Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành tại Trung tâm Đào tạo, Nghiên cứu và Phát triển Nấm ăn và Nấm dược liệu thuộc Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 10 năm 2016 đến tháng 8 năm 2017.
Vật liệu nghiên cứu
3.3.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là 5 chủng nấm đông trùng hạ thảo (Cordyceps militari)
Năm chủng giống nấm C militaris, được ký hiệu ĐT1, ĐT2, ĐT3, ĐT4 và ĐT5, có nguồn gốc từ Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển nấm ăn châu Á Thái Bình Dương tại Phúc Kiến, Trung Quốc.
Trong nghiên cứu này, không sử dụng giống đối chứng do hiện tại ở Việt Nam chưa có chủng Cordyceps militaris nào được công nhận là giống chính thức Về vật tư tiêu hao, hóa chất và nguyên liệu, các yếu tố này đều được chuẩn bị kỹ lưỡng để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của thí nghiệm.
3.3.2.1 Vật tư, hóa chất tiêu hao
- Đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, bông nút, hộp nhựa, bình thủy tinh, màng film , giấy lọc, màng lọc, ống fancol, pipet,.…
- Đường glucose, cao nấm men, pepton, MgSO4.7H2O, KH2PO4 , HCl, NaOH, NaNO3, NH4NO3…
3.3.2.2 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
- Nồi luộc môi trường, bộ cốc đong, rót môi trường, phễu thủy tinh, găng tay, que cấy, dao cấy, cân phân tích, màng lọc, giấy lọc…
Tủ cấy an toàn sinh học, máy li tâm, tủ bảo ôn và các thiết bị như máy khuấy từ, máy lắc, máy xay, bình lên men Duran dung tích 2L, kính hiển vi soi sợi và chụp ảnh, máy đo pH, máy đo độ ẩm - nhiệt độ phòng, máy đo cường độ CO2, máy đo cường độ chiếu sáng, nồi hấp khử trùng, cùng với phòng nuôi giống và nuôi sợi có điều hòa nhiệt độ 2 chiều, quạt thông gió, và bóng đèn huỳnh quang là những thiết bị thiết yếu trong nghiên cứu và sản xuất sinh học, giúp đảm bảo môi trường làm việc an toàn và hiệu quả.
- Nhà nuôi trồng có lắp máy lạnh, có khả năng điều chỉnh nhiệt độ từ 5 -
25 o C; hệ thống thông gió và tưới phun sương tự động; hệ thống đèn LED chiếu sáng, có khả năng điều chỉnh thời gian và cường độ chiếu sáng.
Nội dung nghiên cứu
1 Đánh giá sự sinh trưởng, phát triển hệ sợi của 5 chủng nấm Cordyceps militaris trong giai đoạn nhân giống cấp 1
2 Đánh giá sinh trưởng, phát triển hệ sợi, sinh khối sợi của 5 chủng nấm Cordyceps militaris trong giai đoạn nhân giống cấp trung gian trong môi trường dịch thể
3 Đánh giá sinh trưởng, phát triển hệ sợi, sự hình thành quả thể, tạo năng suất, chất lượng được liệu của 5 chủng nấm Cordyceps militaris trên môi trường nuôi trồng nhân tạo.
Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu gồm 3 thí nghiệm được thực hiện tuần tự từ thí nghiệm 1 đến thí nghiệm 3
3.5.1.1 Thí nghiệm 1 Nghiên cứu sự sinh trưởng, phát triển hệ sợi của 5 chủng nấm Cordyceps militaris trong môi trường nhân giống cấp 1
Giống nấm C.militaris nhân nuôi trên môi trường nhân giống cấp 1 theo phương pháp của Sung et al (2010)
Công thức 1: Giống cấp I của chủng ĐT1 Công thức 2: Giống cấp I của chủng ĐT2
Công thức 3: Giống cấp I của chủng ĐT3 Công thức 4: Giống cấp I của chủng ĐT4 Công thức 5: Giống cấp I của chủng ĐT5
Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 3 lần nhắc lại, mỗi công thức nghiên cứu bao gồm 10 đĩa petri cho mỗi lần nhắc lại Tổng số đĩa petri được sử dụng trong nghiên cứu này là rất lớn, đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả thu được.
30 đĩa petri/1 công thức thí nghiệm Theo dõi các chỉ tiêu sinh trưởng phát triển trên 5 đĩa petri/1 nhắc lại/1 công thức thí nghiệm
3.5.1.2 Thí nghiệm 2 Nghiên cứu sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm Cordyceps militaris trong giai đoạn nhân giống cấp trung gian dạng dịch thể Giống cấp 1 của 5 chủng nấm C militaris được nhân nuôi trên môi trường dịch lỏng theo phương pháp của Zhang et al., (2016)
Công thức 1: Giống cấp trung gian chủng ĐT1
Công thức 2: Giống cấp trung gian chủng ĐT2
Công thức 3: Giống cấp trung gian chủng ĐT3
Công thức 4: Giống cấp trung gian chủng ĐT4
Công thức 5: Giống cấp trung gian chủng ĐT5
Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với ba lần nhắc lại, mỗi công thức nghiên cứu sử dụng năm bình tam giác cho mỗi lần nhắc lại Tổng số bình tam giác trong thí nghiệm là một yếu tố quan trọng để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả.
15 bình/1 công thức thí nghiệm
3.5.1.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu sinh trưởng, phát triển hệ sợi, sự hình thành quả thể, năng suất, chất lượng của 5 chủng nấm Cordyceps militaris trên môi trường nuôi trồng
Nấm C militaris được nuôi trồng trong môi trường với cơ chất gạo lứt, có bổ sung thêm dung dịch dinh dưỡng theo phương pháp của Shrestha et al.,(2012)
Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 3 lần nhắc lại, mỗi công thức nghiên cứu bao gồm 30 hộp cho mỗi lần nhắc lại, tổng cộng có 90 hộp cho mỗi công thức thí nghiệm.
3.5.1.4 Chất lượng dược liệu của nấm C militaris
Hàm lượng Cordycepin và Adenosin trong 1g quả thể khô được xác định thông qua phân tích bằng phương pháp sắc ký HPLC (High Performance Liquid Chromatography) sau khi thu hái và sấy khô Kết quả được trình bày dưới đơn vị mg/g hoặc mg/100g, tùy theo quy định của đơn vị nhận mẫu phân tích.
3.5.2.1 Thí nghiệm 1: Nhân giống cấp 1 nấm C militaris a Chuẩn bị môi trường
Pha môi trường nuôi cấy theo công thức SDAY: 2g Pepton + 2g Cao nấm men + 20g đường glucose + 18g agar + 0,1 g/l KH2PO4 + 0,1 g/l MgSO4 7 H2O + 1000ml nước cất
Hòa tan pepton, cao nấm men và agar trong nước cất theo tỷ lệ, sau đó đun sôi để agar hòa tan hoàn toàn và hớt bọt để nước trong Thêm 20 gam glucose vào dung dịch và điều chỉnh pH của môi trường ở mức 5,5 – 6,5 Cuối cùng, tiến hành hấp khử trùng để đảm bảo môi trường vô trùng.
Đổ 300ml dung dịch vào bình tam giác có thể tích 500ml, sau đó tiến hành hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C trong 60 phút bằng nồi hấp điện tử.
Sau khi tiến hành hấp khử trùng, dịch môi trường sẽ được đổ vào các đĩa petri đã được khử trùng, với lượng khoảng 6 - 10ml cho mỗi đĩa Sau đó, bật đèn UV và để nguội trong 2 – 3 ngày trước khi thực hiện cấy giống gốc sang môi trường cấp I.
Năm chủng C militaris đã được cấy chuyển vào các đĩa petri với kích thước miếng giống là 0,5 x 0,5 cm Sau đó, các đĩa petri được băng kín bằng băng farafin và nuôi sợi trong điều kiện theo bố trí thí nghiệm.
3.5.2.2 Thí nghiệm 2: Nhân giống cấp trung gian nấm Cordyceps militaris dạng dịch thể a Chuẩn bị môi trường
Cơ chất: Gạo lứt 50g/hộp + 65 ml dung dịch ding dưỡng
Dung dịch dd: 1% pepton + 1% cao nấm men + 1g/l MgSO4.7H2O + 2g/l
KH2PO4 + 1000ml nước cất
Các chất được cân theo tỷ lệ chính xác và hòa tan trong nước, sau đó thêm nước cất để đạt đủ thể tích Sử dụng hóa chất NaOH 1M và HCl 1M để điều chỉnh pH về mức 6 – 6,5 Dung dịch đã pha chế được đổ vào chai thủy tinh 500 ml, mỗi chai chứa 250 ml dịch môi trường, sau đó khử trùng ở nhiệt độ 121 độ C trong 60 phút để chuẩn bị dịch giống cấp 1.
Sử dụng giống cấp 1 nấm đông trùng hạ thảo đúng tuổi từ 25 đến 28 ngày là rất quan trọng Giống đúng tuổi được xác định từ thời điểm cấy cho đến khi hệ sợi nấm phát triển kín toàn bộ bề mặt cơ chất.
Hệ sợi của ống giống cấp 1 được hòa tan hoàn toàn trong 100 ml nước cất đã được hấp khử trùng ở 121 độ C trong 60 phút Sau đó, sử dụng máy xay để nghiền nát hệ sợi nấm, tạo thành một dung dịch giống sẵn sàng cho quá trình cấy giống.
Sau khi thanh trùng, chai dịch môi trường được bảo quản trong phòng cấy sạch và khi nhiệt độ dung dịch dưới 30°C, tiến hành cấy giống Thao tác cấy giống diễn ra trong tủ cấy an toàn sinh học để đảm bảo điều kiện vô trùng, giảm thiểu nguy cơ nhiễm Cấy dịch giống cấp I/1 chai môi trường dịch thể theo tỷ lệ 8%.
Các chai dịch sau khi cấy giống được nuôi trên máy lắc 120 vòng/phút Trong điều kiện tối hoàn toàn, nhiệt độ 20 - 22 o C
3.5.2.3 Nuôi trồng nấm Cordyceps militaris a Chuẩn bị môi trường
Mỗi hộp nhựa có kích thước cao 10 cm và dung tích 750 ml, chứa 50g gạo lứt và 65ml dung dịch dinh dưỡng Công thức môi trường sẽ tùy thuộc vào từng loại công thức cụ thể Miệng hộp được đậy kín bằng túi nilon PE và chun buộc để đảm bảo an toàn Quá trình hấp khử trùng được thực hiện để bảo quản sản phẩm tốt hơn.
Môi trường được hấp khử trùng ở 121 o C trong thời gian 60 phút c Cấy giống
Môi trường khử trùng được để nguội rồi tiến hành cấy giống
Loại giống: Giống C militaris cấp trung gian dạng dịch thể 5 ngày tuổi
Tỷ lệ giống cấy từ 10 ml giống/hộp môi trường d Nuôi sợi
Giống nấm sau khi cấy được ươm sợi trong điều kiện nhiệt độ 20 - 22 o C, độ ẩm không khí 60 - 70% e Nuôi quả thể và thu hái
Sau khi cấy giống, hệ sợi nấm phát triển kín toàn bộ cơ chất và chuyển sang giai đoạn sinh trưởng sinh thực Trong giai đoạn này, cần điều chỉnh các điều kiện chăm sóc phù hợp, bao gồm duy trì nhiệt độ từ 18 đến 22 độ C và độ ẩm từ 85% đến 90%.
Phương phát xử lý số liệu
Kết quả nghiên cứu được sử lý số liệu bằng bằng phần mềm Excel 2010 và phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm IRRISTAT 5.0.
