Mởđầu
Tính cấp thiết của đề tài
Rhamnetin là một flavonoid thuộc nhóm flavonol với vị trí methyl hóa ở carbon số 7 (C7), có nhiều hoạt tính sinh học mạnh mẽ như kháng viêm, kháng khuẩn và ức chế khối u Tuy nhiên, việc chiết xuất rhamnetin glycoside từ thực vật gặp khó khăn do hàm lượng thấp và dễ lẫn tạp, đòi hỏi nhiều kỹ thuật và thời gian Phương pháp tổng hợp hóa hữu cơ cũng gặp hạn chế do tính tương tác không đặc hiệu và điều kiện phản ứng phức tạp Do đó, ứng dụng sinh học phân tử, công nghệ vi sinh và công nghệ lên men để tổng hợp rhamnetin glycoside đã được đề xuất như một giải pháp thay thế Tại Việt Nam, các hợp chất flavonoid chủ yếu được sinh tổng hợp và tách chiết từ thực vật ở quy mô phòng thí nghiệm, nhưng nghiên cứu về vi sinh vật cải biến di truyền để tạo ra hợp chất thiên nhiên vẫn chưa được thực hiện Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài này.
Nghiên cứu sinh đã tổng hợp thành công hoạt chất rhamnetin-3-O-rhamnoside từ vi khuẩn Escherichia coli thông qua phương pháp đường hóa các chất tự nhiên bằng vi khuẩn di truyền Sản phẩm rhamnetin glycoside này có ý nghĩa quan trọng trong nhiều lĩnh vực như y học, mỹ phẩm và thực phẩm.
Mục tiêu nghiên cứu
Quy trình sinh tổng hợp hợp chất rhamnetin-3-O-rhamnoside được thiết lập bằng cách sử dụng vi khuẩn E coli đã được cải biến di truyền Nghiên cứu này đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy nhằm tối ưu hóa sản xuất hợp chất mục tiêu.
Phạm vi nghiên cứu
Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm thuộc Trung tâm Sinh học Phân tử - Đại học Duy Tân – Đà Nẵng, thời gian thực hiện: 02/2017 - 10/2017.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu
Nghiên cứu này sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học và hệ thống về việc nuôi cấy tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside trong E coli tái tổ hợp thông qua phương pháp chuyển hóa sinh học trong điều kiện in-vivo, từ đó mở ra những ứng dụng thực tiễn quan trọng trong lĩnh vực sinh học và công nghệ sinh học.
Kết quả của đề tài luận văn cung cấp cơ sở khoa học quan trọng cho việc phát triển hệ thống nuôi cấy và lên men huyền phù tế bào E coli tái tổ hợp, nhằm tổng hợp nhanh hợp chất rhamnetin-3-O-rhamnoside ở quy mô lớn hơn (pilot) Hoạt chất này có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất thuốc, mỹ phẩm và thực phẩm, góp phần cải thiện sức khỏe con người.
quan tài liệu
Khái quát về flavonoid
Các flavonoid là những chất có khung cơ bản theo kiểu C6-C3-C6, khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua 1 mạch 3 carbon
Các flavonoid được phân loại dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và mức độ oxy hóa của mạch 3 carbon Chúng được chia thành ba nhóm chính: euflavonoid với gốc aryl ở vị trí C-2, isoflavonoid với gốc aryl ở vị trí C-3, và neoflavonoid với gốc aryl ở vị trí C-4 (Đại học Thành Đô, 2015).
Hình 2.1 Phân loại flavonoid dựa vào gốc aryl (vòng B)
Euflavonoid là nhóm flavonoid lớn nhất và được biết đến sớm nhất, bao gồm nhiều phân nhóm như flavan, flavan-3-ol, flavan-4-ol, flavan-3,4-diol, anthocyanidin, dihydrochalcon, chalcon, auron, flavanon, 3-hydroxy flavanon, flavon và flavonon.
Flavonol là một nhóm flavonoid có cấu trúc 3-hydroxylflavone, thường là các tinh thể màu vàng nhạt đến vàng Các dẫn xuất flavonol rất phổ biến trong thực vật và sự đa dạng của chúng đến từ vị trí khác nhau của các nhóm phenolic –OH.
Hình 2.2 Các cấu trúc khung cơ bản của một số nhóm flavonoid thường gặp Bảng 1.1 Phân loại một số lớp flavonoid thường gặp ở thực vật
Các phân lớp flavonoid Các đại diện thường gặp Nguồn thực vật
Các loại quả dâu đỏ, xanh, tím
Nước ép cam, quýt, táo
Flavones Apigenin, Luteolin Hạt tiêu, ngũ cốc, mùi tây, cần tây
Catechins có mặt trong trà (đặc biệt trà xanh), chocolate, nho, dâu, táo
Giới thiệu rhamnetin và một số dẫn xuất rhamnetin glycoside thường gặp
Rhamnetin, với công thức hóa học C16H12O7 và khối lượng phân tử 316,26g/mol, thường xuất hiện dưới dạng tinh thể màu vàng nhạt Cấu trúc phân tử của rhamnetin được phát hiện bởi nhà hóa học người Áo Josef Herzig (1853-1942).
Hình 2.3 Phân bố của rhamnetin ở một số loài thực vật
Rhamnetin đã được phát hiện trong nhiều loại thực vật như hồ tiêu (Piper rigrum), thanh hao hoa vàng (Artemisia annua), keo cao (Acacia catechu) và cần Ami (Ammi visnaga) Cây keo cao từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền Trung Quốc nhờ vào tác dụng hạ sốt và kháng khuẩn Nghiên cứu cho thấy rhamnetin có thể được tách ra từ dịch chiết của cây với hàm lượng 13 mg/1 kg nguyên liệu thô (Li et al., 2011) Giống như nhiều flavonoid khác, rhamnetin thường tồn tại dưới dạng đường hóa để duy trì hoạt tính sinh học mạnh mẽ, và hiện nay đã phát hiện một số dẫn xuất có gắn đường của hợp chất này.
Hình 2.4 Rhamnetin và một số dẫn xuất của chúng
Con đường sinh tổng hợp rhamnetin và dẫn xuất rhamnetin-3-o-rhamnoside ở thực vật
Chuỗi sinh tổng hợp rhamnetin bao gồm hai giai đoạn chính Giai đoạn đầu diễn ra trong lạp thể, nơi cung cấp các acid amin L-tyrosine, L-phenylalanin và manonyl-CoA Ở giai đoạn thứ hai, trong tế bào chất, các acid amin này được enzyme tyrosine amoniac lyase (TAL) hoặc phenylalanine amoniac lyase (PAL) chuyển đổi thành các dẫn xuất acid carboxylic, cụ thể là p-coumaric acid và acid cinnamic Nghiên cứu cho thấy acid cinnamic được chuyển hóa thành acid p-coumaric nhờ enzyme acid cinnamic 4-hydroxylase (C4H) Sau đó, 4-coumaroyl-CoA ligase (4CL) chuyển acid p-coumaric thành 4-coumaroyl-CoA Cuối cùng, một phân tử p-coumaroyl-CoA sẽ phản ứng với ba phân tử manonyl-CoA để tạo thành naringenin chalcone với cấu trúc khung cơ bản C6.
Chalcone synthase (CHS) catalyzes the conversion of C3-C6 compounds into chalcone, which serves as the backbone structure for most flavonoids Subsequently, narigenin chalcone is transformed into narigenin through a cyclization reaction facilitated by chalcone isomerase (CHI) This process involves various enzymes, including flavone 3β-hydroxylase (F3H), flavonol synthase (FLS), O-methyltransferase (OMT), and flavonol 3-O-glycosyltransferase (F3GT), leading to the production of intermediate compounds such as dihydroflavonol, quercetin, rhamnetin, and rhamnetin-rhamnoside (Sung et al., 2011a; Thuan et al., 2013a; Kim et al., 2010).
Nghiên cứu của Marczak et al đã chỉ ra rằng rhamnetin có thể được sản xuất từ các loài thực vật thuộc chi Drosera thông qua phương pháp nuôi cấy in vitro Nhóm nghiên cứu đã tiến hành nuôi cấy 6 loài Drosera, bao gồm D adelae, D aliciae, D capensis, D cuneifolia, D ramentacea và D binata Sau 8 tuần nuôi cấy, mẫu được chiết xuất bằng bộ chiết Soxhlet với 50ml chloroform hoặc methanol trong 12 giờ, tiếp theo là chiết với 50ml methanol trong 12 giờ Ngoài ra, phương pháp siêu âm cũng được áp dụng với 20ml chloroform hoặc methanol, siêu âm ở tần số 50-60Hz trong 30 phút Dịch chiết thu được được ly tâm và đông khô, sau đó hòa tan với 3ml methanol và bảo quản ở -20°C Các mẫu chiết xuất được pha loãng 5 lần bằng methanol để phân tích HPLC, từ đó xác định được các flavonoid, bao gồm rhamnetin (Marczak L et al., 2005).
The article discusses key enzymes involved in phenolic compound biosynthesis, including TAL (tyrosine ammonia lyase), 4CL (p-Coumaroyl-CoA ligase), PAL (phenyl ammonia lyase), C4H (cinnamic acid 4-hydroxylase), CPR (cytochrome P450 reductase), CHS (chalcone synthase), CHI (chalcone isomerase), F3H (flavone 3β-hydroxylase), FLS (flavonol synthase), and OMT (O-methyltransferase) These enzymes play crucial roles in the metabolic pathways leading to the production of various flavonoids and phenolic compounds, which are essential for plant defense and human health.
Hình 2.5 Tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside ở thực vật
Một số phương pháp nghiên cứu tổng hợp rhamnetin và dẫn xuất rhamnetin
VÀ DẪN XUẤT RHAMNETIN GLYCOSIDE
2.4.1 Vai trò của các enzyme
Dựa trên việc phát hiện con đường tổng hợp rhamnetin, có ba nhóm enzyme được phân loại: nhóm đầu tiên tham gia vào việc tổng hợp cấu trúc khung xương của flavonoid, bao gồm các enzyme như 4-CL, CHS, CHI; nhóm thứ hai trực tiếp tổng hợp rhamnetin từ narigenin với các enzyme như F3H, FLS, OMT; và nhóm thứ ba là các glycosyltransferase, chịu trách nhiệm tạo ra các dẫn xuất glycoside tương ứng.
Nghiên cứu sử dụng enzyme O-glycosyltransferase thông qua phương pháp tạo dòng vào các vector biểu hiện có promoter mạnh, sau đó chuyển vào vật chủ, cho phép tạo ra thể tái tổ hợp phục vụ mục đích sinh tổng hợp rhamnetin và các dẫn xuất glycoside Enzyme glycosyltransferase đóng vai trò quan trọng trong quá trình đường hóa, tham gia vào việc tổng hợp đường hoạt hóa.
Glycosyltransferase (GT) là enzyme có chức năng chuyển nhóm glycosyl từ cơ chất dưới dạng đường hoạt hóa (NDP-sugar) sang cơ chất nhận (acceptor) Các enzyme GT được chia thành hai nhóm chính là GT-A và GT-B dựa trên cấu trúc Rossman trong phân tử Theo cơ chế tác dụng, GT được phân loại thành enzyme đảo (inverting) và enzyme nguyên (retaining) Ngoài ra, enzyme GT còn được chia thành O- và C-glycosyltransferases, trong đó O-glycosyltransferase chuyển nhóm glycosyl tới nguyên tử oxygen của cơ chất nhận, còn C-glycosyltransferases có nguyên tử nhận là carbon trên aglycone.
Cơ chế đảo (invertion) liên quan đến sự thay đổi cấu hình lập thể của liên kết bất đối (anomeric bond) của NDP-hexose, chuyển từ dạng α sang β hoặc ngược lại sau khi phản ứng xảy ra Ngược lại, cơ chế giữ nguyên (retention) cho thấy cấu hình lập thể của liên kết này không thay đổi, tức là α vẫn giữ nguyên là α hoặc β vẫn giữ nguyên là β.
Đến nay, đã có nhiều loại enzyme glycosyltransferase (GT) được phát hiện từ thực vật và vi sinh vật, trong đó uridin diphosphate glycosyltransferase (UGT) từ thực vật là được nghiên cứu nhiều nhất Chẳng hạn, cây Arabidopsis thaliana có tới 120 gene mã hóa cho UGT Ngoài ra, các UGT cũng được tìm thấy ở các loài thực vật khác như Medicago truncatula và Vitis vinifera.
Oryza sativa và Glycin max đã được nghiên cứu về đặc tính sinh hóa, trong đó các gen từ vi sinh vật có khả năng xúc tác chuyển đổi nhiều loại phân tử đường hoạt hóa với các nhóm TDP, UDP và GDP đã được phát hiện Những gen này đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp nhân tạo nhiều hợp chất glycoside mới (Zhang et al., 2006).
Hình 2.6 Cơ chế phản ứng của enzyme glycosyltransferases, (A)
Enzyme GT của vi khuẩn có khả năng xúc tác cho phản ứng kết hợp của nhiều loại cơ chất, với nhiều điểm gắn trong cấu trúc phân tử hơn so với UGT từ thực vật Chúng thường có tính đặc hiệu không tuyệt đối, dẫn đến việc enzyme GT từ vi sinh vật tạo ra nhiều loại sản phẩm đường hóa Điều này mang lại ý nghĩa quan trọng trong công nghệ sinh học dược.
Con đường sinh tổng hợp đường NDP-rhamnose liên quan đến việc hoạt hóa NDP-L-rhamnose, một thành phần quan trọng trong glycoprotein, exopolysaccharides (EPS) và thành tế bào nấm Trong vi khuẩn, dTDP-L-rhamnose được sử dụng để tổng hợp glycolipid và polysaccharide phức hợp Quá trình tổng hợp NDP-rhamnose ở vi khuẩn diễn ra nhờ ba gen mã hóa cho các enzyme 4,6-dehydratase (RmlB), 3,5-epimerase (RmlD) và 4-reductase Cụ thể, enzyme 4,6-dehydratase chuyển hóa dTDP-D-glucose thành dTDP-4-keto-6-deoxyglucose, sau đó sản phẩm này được chuyển đổi thành dTDP-4-keto-rhamnose và cuối cùng khử thành dTDP-rhamnose Ngoài ra, thực vật có enzyme riêng (Rhm, URS) có khả năng chuyển hóa UDP-Glucose thành UDP-Rhamnose.
Hình 2.7 Sơ đồ sinh tổng hợp đường hoạt hóa NDP-rhamnose
In plants, a dual-function protein performs both 3,5-epimerization at positions C3 and C5 and 4-reduction at position C4 (Watt et al., 2004) The synthesis of UDP-rhamnose in fungi requires two genes coding for enzymes, including UDP-glucose 4,6-dehydratase, which converts UDP-glucose into UDP-4-keto-6-deoxyglucose Subsequently, a bifunctional enzyme (UDP-4-keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase/-4-reductase) transforms UDP-4-keto-6-deoxyglucose into UDP-rhamnose (Martinez et al., 2012).
Quá trình đường hóa (glycosylation) là một trong những quá trình quan trọng nhất trong việc cải biến phân tử hợp chất tự nhiên, trong đó phân tử đường từ chất cho (donor) được chuyển đến chất nhận (acceptor) thông qua việc hình thành liên kết glycosidic Cấu trúc của hợp chất glycoside phụ thuộc vào phân tử đường (glycone) và phần gắn với đường (aglycone) Đường hóa thường là bước cuối cùng trong tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp của thực vật, mang lại ý nghĩa quan trọng về hóa học và dược lý Đặc biệt, quá trình đường hóa flavonoid xảy ra ở nhóm hydroxyl hoặc trực tiếp trên nguyên tử carbon của bộ khung, với các enzyme glycosyltransferase (GT) từ thực vật như Arabidopsis và Withania, cũng như từ vi khuẩn như Streptomyces, Bacillus và Streptococcus.
Rhamnetin có khả năng hòa tan tốt trong các dung môi hữu cơ phân cực như acetone, methanol và DMSO, nhưng lại ít hòa tan trong nước, điều này hạn chế sự trao đổi qua màng tế bào Việc gắn một hoặc nhiều gốc đường vào các vị trí khác nhau của phân tử rhamnetin tạo thành rhamnetin glycoside không chỉ cải thiện độ hòa tan mà còn tăng tính ổn định và hoạt tính sinh học so với phân tử gốc.
2.4.1.2 Một số enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp phân tử đường hoạt hóa ở vi khuẩn E coli cải biến di truyền
Các enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp các hợp chất đường hoạt hóa như NDP-glucose, NDP-galactose, và NDP-glucoronate đã được xác định, cùng với các phân tử đường hiếm như NDP-rhamnose, NDP-fuctose, NDP-allose, và NDP-arabinose Do hàm lượng đường hiếm trong E coli rất thấp, người ta thường tăng cường biểu hiện các enzyme liên quan bằng cách tạo ra các chủng E coli tái tổ hợp mang gen từ các loài khác E coli là đối tượng dễ thao tác di truyền với bộ gene nhỏ và vòng đời ngắn, do đó, ngày càng nhiều chiến thuật sử dụng chúng trong sinh tổng hợp các phân tử đường hiếm.
2.4.2 Một số phương pháp tổng hợp rhamnetin
2.4.2.1 Tổng hợp rhamnetin bằng nuôi cấy mô tế bào
Nghiên cứu sản xuất rhamnetin trong thực vật thông qua nuôi cấy in-vitro các loài thuộc chi Drosera đã được thực hiện Nhóm nghiên cứu đã nuôi cấy mô của sáu loài, bao gồm D adelae, D aliciae, D capensis, D cuneifolia, D ramentacea và D binata Kết quả phân tích dịch chiết cho thấy sự hiện diện của rhamnetin và isorhamnetin, tuy nhiên chỉ với hàm lượng vết (Marczak et al., 2005).
2.4.2.2 Phương pháp tổng hợp in-vitro Đây là phương pháp tổng hợp kinh điển đã được áp dụng từ lâu Người ta có thể tách chiết enzyme trực tiếp từ mô, tế bào thực vật hoặc biểu hiện dưới dạng tái tổ hợp trong vật chủ khác rồi tinh sạch enzyme sử dụng cho phản ứng in- vitro Sau đó sử dụng các phương pháp sắc ký nhằm phát hiện, định lượng và định tính sản phẩm Về sau, cùng với sự phát hiện ra các enzyme tham gia trong chuỗi tổng hợp đường hoạt hóa thì có thể tiến hành tổng hợp bằng cách cho tất cả các enzyme này cùng với GTs và cơ chất vào cùng một thời điểm để tiến hành phản ứng (one-pot enzymatic reaction)
Phát hiện các enzyme có khả năng xúc tác "mềm dẻo" đã dẫn đến sự ra đời của phương pháp in-vitro glycorandomization, cho phép tiếp nhận nhiều phân tử đường hoạt hóa khác nhau Thorson et al đã áp dụng phương pháp này để tạo ra nhiều dẫn xuất glycoside từ các hợp chất như novobiocin, digitoxin, vancomycin, colchicine và 4-methylumbelliferone Một ví dụ khác là enzyme Sa-OMT2 được tách từ Streptomyces avermitilis MA-4680, sau đó biểu hiện trong E coli, cho phép chuyển nhóm methyl vào vị trí 7-hydroxyl trên nhiều chất như isoflavone, daidzein và genistein Phương pháp này kết hợp ưu điểm của tổng hợp hóa học với khả năng phản ứng đặc hiệu của enzyme Tuy nhiên, nó cũng gặp phải hai nhược điểm lớn: thiếu nguồn chất đường hoạt hóa do chi phí cao và khó khăn trong việc sàng lọc các enzyme GT đặc hiệu nhóm cần thiết.
GT có hoạt tính là không hề dễ dàng
Các hoạt tính sinh học của rhamnetin
Nghiên cứu đã chỉ ra rằng rhamnetin sở hữu nhiều hoạt tính sinh học quan trọng, bao gồm khả năng kháng ung thư, kháng viêm và chống oxy hóa Dưới đây là một số công trình nghiên cứu liên quan đến hợp chất này.
Bảng 2.1 Một số hoạt tính sinh học của rhamnetin
Hoạt tính sinh học Đích tác động Tài liệu tham khảo
Hoạt tính kháng ung thư
Con đường Notch-1 xảy ra ở tế bào gan bị ung thư, thực hiện trên các tế bào HepG2, MHCC-97L và L-02 và một dòng kháng thuốc HepG2/ADR
Con đường tín hiệu Notch – 1, thực hiện trên các tế bào ung thư phổi, NCI-H1299 và NCI-H460
Ung thư tuyến tiền liệt trên mô hình thí nghiệm ở chuột (Oak et al.,
Hoạt tính chống oxy hóa Điều trị tế bào ung thư MDA-MB-231 ở người (Lee et al.,
2011) Quá trình tự chết của tế bào H9C2 được kích thích bởi miconazole
2015) Tác dụng chống oxy hóa đối và rỏ rỉ phóng xạ với người bị ung thư tuyến tiền liệt
2014) Phục hồi ở bệnh nhân bị tổn thương não bộ thông qua ức chế phản ứng viêm và giảm sự hình thành các gốc tự do ở vùng hippocampus
Nghiên cứu cho thấy việc giảm lượng cholesterol trong máu của chuột ăn chế độ giàu cholesterol có thể ngăn chặn sự hình thành oxide kim loại (O2 -) ở những con chuột thí nghiệm.
Tác động hiệp đồng với thụ thể 7-nAChR, một loại thụ thể alpha 7, đóng vai trò quan trọng trong việc truyền tín hiệu trong hệ thần kinh trung ương Sự phân bố rộng rãi của 7-nAChR cho thấy tầm ảnh hưởng của nó đối với các chức năng thần kinh và các quá trình sinh lý khác.
Tầm quan trọng của việc nghiên cứu sinh tổng hợp rhamnetin-3-O- rhamnoside
Đường hóa các hợp chất tự nhiên thông qua việc gắn với phân tử đường (glycone) đã tạo ra các glycoside với hoạt tính sinh học và dược học mạnh hơn, làm thay đổi đáng kể đặc tính của hợp chất so với phân tử mẹ Chẳng hạn, việc gắn gốc đường rhamnose vào glucose trong naringenin-7-O-glucoside đã gây ra vị đắng của nho hoặc vị không có của quýt Phân tử cyanidin-3-O-glucoside trong cây bông có khả năng bảo vệ chống lại sâu ăn lá, trong khi cyanidin (aglycone) lại không có tác dụng này Các glycoside silybin-7-β-glucoside và các dẫn xuất tại vị trí C-23 cho thấy tính tan cao hơn so với aglycone silybin Sự hiện diện của các gốc đường khác nhau cũng tạo ra tính chất khác biệt cho glycoside, với hoạt tính chống oxy của β-glucoside cao hơn 10 lần so với aglycone Hoạt tính bảo vệ tế bào gan của silybin-β-galactoside là cao nhất trong các nhóm thử nghiệm, có thể do gốc đường galactosyl có ái lực lớn với tế bào gan Với vai trò quan trọng của chúng, các hợp chất này đang thu hút sự quan tâm của cộng đồng khoa học toàn cầu, và nhu cầu về flavonoid glycoside cùng các dẫn xuất của chúng ngày càng tăng, dẫn đến việc tinh chế và tổng hợp các hợp chất này theo phương pháp truyền thống không còn đáp ứng đủ yêu cầu thực tiễn.
Rhamnetin, với các hoạt tính sinh học nổi bật, đã trở thành hợp chất hứa hẹn trong nghiên cứu và điều trị Do đó, nó là cơ chất quan trọng để phát triển các dẫn xuất với hy vọng có hoạt tính sinh học mạnh mẽ hơn hoặc hoạt tính mới Chúng tôi tiến hành nghiên cứu quá trình chuyển hóa rhamnetin thành rhamnetin-3-O-rhamnoside bằng cách sử dụng vi khuẩn E coli tái tổ hợp di truyền.
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu
Nghiên cứu tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside được thực hiện bằng cách sử dụng chủng vi khuẩn E coli BL21(DE3) biến đổi gen, mang gen UDP-glycosyltransferase từ Arabidopsis thaliana (ArGT3, At1g30530) và cụm gen tăng cường tổng hợp thymidine diphosphate (TDP)-α-L-rhamnose Để tối ưu hóa quá trình sản xuất, hai gen D-glucose-phosphate isomerase (pgi) và D-glucose-6-phosphate dehydrogenase (zwf) đã được loại bỏ, nhằm tăng cường tích lũy glucose-1-phosphate, tiền chất cần thiết cho sản xuất TDP-L-rhamnose Cơ chất được sử dụng trong nghiên cứu là rhamnetin Sơ đồ thiết kế của vi khuẩn E coli tái tổ hợp được trình bày trong hình 3.1.
Nội dung 1 Thí nghiệm tổng hợp và phát hiện rhamnetin-3-O-rhamnoside
Nội dung 2 Đánh giá ảnh hưởng của môi trường, nồng độ IPTG và nhiệt độ lên hiệu suất sinh tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside
Chủng vi khuẩn E coli BL21(DE3)/Δpgi/Δzwf (chủng M3G3) tái tổ hợp được sử dụng làm vật chủ (hình 3.1) (Thuan et al., 2013a)
3.1.3.2 Dụng cụ, trang thiết bị thí nghiệm
Các loại máy móc dùng khuấy mẫu, cô quay, đông khô và chai lọ làm thí nghiệm, v.v thuộc Trung tâm Sinh học Phân tử, Đại học Duy Tân
Màng lọc Sartorius 0,25 µm (Sartorius, Mỹ) và bản mỏng sắc ký (Merck, Đức) được sử dụng cùng với máy phân tích sắc ký lỏng cao áp HPLC 1260 (Agilent, Mỹ) Mẫu được gửi đi phân tích sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS) tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
The article discusses various chemicals and solvents used in extraction processes, including rhamnetin from Sigma (USA), IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) from Merck (Germany), and antibiotics such as ampicillin, chloramphenicol, and streptomycin from Biobasics (Canada) It also mentions solvents like ethyl acetate, methanol, and ethanol sourced from Taiwan and South Korea.
Hình 3.1 Sơ đồ hệ thống E coli tái tổ hợp
The article discusses various expression vectors used in genetic engineering, specifically pET28a, pCDF-Duet, and pACYC-Duet The pET28a vector contains the ArGT3 gene for glycosyltransferase and a kanamycin resistance gene The pCDF-Duet vector carries the TDP glucose synthase (TGS) and dehydrogenase (DH) genes along with a streptomycin resistance gene Lastly, the pACYC-Duet vector includes the epimerase (EP) and ketoreductase (KR) genes, paired with a chloramphenicol resistance gene.
- Chủng vi khuẩn được nuôi qua đêm trên đĩa thạch LB có chứa kháng sinh Kanamycin, Streptomycin nồng độ 100 àg/mL và Chloramphenicol nồng độ 30 àg/mL ở 37°C
- Cấy chuyển ra ống nghiệm chứa 4mL môi trường TB có chứa kháng sinh Kanamycin, Streptomycin, Chloramphenicol nuôi qua đêm ở 37°C tốc độ lắc 220 vòng/phút
- 500àL dịch nuụi sau đú được chuyển sang bỡnh định mức 250mL chứa 50 mL môi trường TB (hoặc môi trường khác tùy theo thí nghiệm) nuôi ở 37°C và
IPTG được bổ sung với nồng độ cuối cùng từ 0-1 mM, tùy thuộc vào yêu cầu của thí nghiệm, khi mật độ quang học (OD600) của dịch nuôi đạt 0,6 tại bước sóng 600nm.
Để tạo điều kiện cho các protein tái tổ hợp biểu hiện, hãy hạ nhiệt độ xuống 32°C (hoặc mức nhiệt độ phù hợp với yêu cầu thí nghiệm) và tiếp tục nuôi cấy trong khoảng thời gian từ 3 đến 5 giờ.
- Bổ sung rhamnetin đã hòa tan trong hỗn hợp methanol và DMSO (v/v = 9:1) với nồng độ cuối cựng là 30àM, nuụi tiếp trong 24h sau đú tiến hành tỏch chiết
- Mẫu đối chứng được tiến hành nuôi đồng thời cùng mẫu thí nghiệm và không bổ sung cơ chất rhamnetin
Hình 3.2 Sơ đồ chuyển hóa tạo sản phẩm rhamnetin-3-O-rhamnoside
Hình 3.3 Nuôi cấy chủng giống gốc 3.1.4.2 Phương pháp cô quay chân không
Phương pháp cô quay chân không sử dụng bay hơi chân không để giảm nhiệt độ sôi của các thành phần trong hệ kín, giúp loại bỏ dung môi từ mẫu dịch chiết Nhiệt độ cho phép phụ thuộc vào độ sôi của hợp chất, chất tan và dung môi, cho phép loại bỏ hầu hết các dung môi có nhiệt độ sôi thấp Tuy nhiên, các dung môi có nhiệt độ sôi cao như nước thường là dung môi cuối cùng còn lại Để loại bỏ hoàn toàn nước và dung môi còn sót lại, phương pháp đông khô là lựa chọn hiệu quả.
- Pha dung môi Ethyl acetate:Methanol = 9:1 (tỷ lệ tính theo thể tích, v/v)
- Lấy 100mL dung môi đã pha cho vào bình chứa dịch nuôi, lắc đều ở 200 vòng/phút trong 2h
- Thu dịch trên, ly tâm tốc độ 12.000 vòng/phút trong 10 phút
- Lọc qua màng lọc sartorius cú đường kớnh 0,25àm thu dịch chiết
- Tiến hành cô quay chân không để loại bỏ dung môi
Hình 3.4 Cô quay thu nhận dịch chiết thô
Phương pháp đông khô là kỹ thuật loại bỏ hoàn toàn nước khỏi sản phẩm đông lạnh thông qua quá trình thăng hoa Sản phẩm được đông lạnh ở nhiệt độ -70°C, sau đó chuyển trực tiếp từ thể rắn sang thể hơi mà không qua pha lỏng.
Quá trình sấy thăng hoa bao gồm ba giai đoạn: giai đoạn làm lạnh; giai đoạn sấy sơ cấp và giai đoạn sấy thứ cấp
Giai đoạn 1 – Giai đoạn Tiền đông (prefreezing) là bước đầu tiên trong quá trình đông khô, trong đó vật liệu sấy chuyển từ trạng thái lỏng sang trạng thái khí Để thực hiện quá trình này, vật liệu đông khô cần được làm lạnh đến nhiệt độ thích hợp Cách thức đông lạnh và nhiệt độ cuối cùng của sản phẩm lạnh đông đóng vai trò quan trọng trong việc xác định khả năng thành công của quá trình đông khô vật liệu sấy.
Giai đoạn 2 – Giai đoạn sấy thăng hoa là quá trình quan trọng sau khi sản phẩm đã được đông lạnh, nhằm tách băng nước khỏi sản phẩm Quá trình này yêu cầu thiết lập các điều kiện chính xác để đảm bảo sản phẩm khô với cấu trúc được bảo toàn Việc kiểm soát nhiệt độ và áp suất là yếu tố then chốt trong giai đoạn này.
Giai đoạn 3, hay giai đoạn sấy thứ cấp, diễn ra sau khi giai đoạn 2 kết thúc và toàn bộ băng đã thăng hoa Mặc dù sản phẩm có vẻ khô, nhưng vẫn còn khoảng 7-8% ẩm liên kết bên trong Để đạt hiệu suất tối đa trong việc loại bỏ ẩm này, giai đoạn sấy thứ cấp cần được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn Quá trình này được gọi là sự giải hấp đẳng nhiệt, trong đó ẩm liên kết sẽ được bay hơi khỏi sản phẩm.
Sản phẩm sau khi đông khô được pha với 1mL methanol để tiến hành các thí nghiệm xác định chất
3.1.4.4 Phương pháp định tính, định lượng a Phương pháp sắc ký bản mỏng
- Chuẩn bị bản mỏng sắc ký và đánh dấu vị trí của cơ chất, mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng
Pha dung môi theo tỷ lệ ethyl acetate, methanol, toluene và nước cất với tỉ lệ 8:1:0,5:1 (theo thể tích, v/v) Sau khi pha, lắc nhẹ và để dung dịch trong bình có nắp đậy trong 15 phút.
Đưa ống mao quản vào từng mẫu và chấm lên các vị trí tương ứng trên bản mỏng sắc ký đã chuẩn bị Sau mỗi lần chấm, cần chờ cho vết chấm khô trước khi tiếp tục chấm, thực hiện khoảng 5 đến 8 lần tùy thuộc vào từng loại chất.
Sau khi hoàn thành quá trình chấm, cần sấy khô mẫu và cho vào bình chứa dung môi, sau đó đậy nắp và chờ trong 15 phút Tiếp theo, quan sát mẫu dưới đèn UV ở bước sóng 280nm để phân tích Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sẽ được áp dụng để xác định các thành phần trong mẫu.
- Dịch chiết thu được đem ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch trong và tiến hành kiểm tra định tính bằng HPLC
- Sử dụng hệ dung môi gồm: A: nước chứa 0,1% formic acid và B: acetonitrile 100%
- Hệ chương trình chạy HPLC gồm dung môi B: 10 % trong 0–5 phút, 10– 30% trong 5–15 phút, 30–80 % trong 15–25 phút, và 80–100% trong 25–30 phút
- Cột chạy đảo pha C18 Zorbax extend (Agilent, Mỹ)
- Tốc độ dòng và bước sóng lần lượt là: 1.0 mL/phút và 280 nm
Hình 3.5 Máy phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Định lượng sản phẩm rhamnetin-3-O-rhamnoside
Chất chuẩn rhamnetin-3-O-rhamnoside được cung cấp bởi hãng Sigma và được pha loãng thành các nồng độ khác nhau: 0,01; 0,05; 0,1; 0,5 và 1 mg/mL Sau khi chạy mẫu, phương trình đường chuẩn đã được xây dựng và kết quả được trình bày trong hình dưới đây.
