Đối tượng nội dung phương pháp nghiên cứu
Đối tượng địa điểm thời gian nghiên cứu
- Các mẫu thịt lợn thu thập được tại một số chợ thuộc quận Long Biên, Hà Nội
Trong điều kiện cho phép, phạm vi đề tài chỉ đề cập đến các chỉ tiêu: Vi khuẩn E coli, vi khuẩn Salmonella
3.1.3 Địa điểm nghiên cứu Địa điểm lấy mẫu: mẫu được thu thập tại một số chợ thuộc quận Long Biên,
Hà Nội là địa điểm phân tích mẫu, sau khi thu thập, các mẫu sẽ được chuyển đến Phòng thí nghiệm Bộ môn Thú y cộng đồng thuộc Khoa Thú y của Học viện Nông nghiệp Việt Nam để tiến hành phân tích.
3.1.4 Thời gian nghiên cứu Đề tài được nghiên cứu và thực hiện từ tháng 12 năm 2018 đến tháng 07 năm 2019
Nội dung nghiên cứu
- Điều tra hiện trang phân phối thịt lợn tại Quận Long Biên
- Ngiên cứu xác dịnh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E coli và Salmonella trong thịt lợn tại một số chợ nhỏ lẻ trên địa bàn quận Long Biên
- Xác định tính khánh kháng sinh của vi khuẩn phân lập được.
Vật liệu nghiên cứu
Mẫu thịt lợn được lấy vào 7-8 giờ sáng tại một số chợ thuộc quận Long Biên, Hà Nội
3.3.2.1 Hóa chất, môi trường phân lập và giám định vi khuẩn E coli
Môi trường Pepton Buffered Water (PBW), môi trường MacConkey (Mac)
3.3.2.2 Hóa chất, môi trường phân lập và giám định vi khuẩn Salmonella
Môi trường tăng sinh Pepton Buffered Water (PBW), môi trường canh
Rappaport-Vassiliadis Soya Pepton (RV), Muller Kauffman Tetrathionate (MKTTn), Xylose-Lysine-Tergitol 4 (XLT4), Brilliant Green Agar (BGA), Triple Sugar Iron Agar (TSI), SS agar, blood agar, and Kovac's reagent are essential microbiological media and reagents used for the isolation and identification of various bacterial species These environments provide the necessary nutrients and conditions for the growth of specific microorganisms, facilitating accurate laboratory analysis and research.
3.3.2.3 Hóa chất, môi trường dùng làm kháng sinh đồ
The antibiotic susceptibility testing paper discs contain various antibiotics, including Sulfamethoxazole/Trimethoprim (STX) at 25 µg, Ampicillin (AMP) at 10 µg, Colistin (COL) at 10 µg, Amoxicillin (AMX) at 10 µg, Neomycin (NEO) at 30 µg, Kanamycin (KAN) at 30 µg, Doxycycline (DOX) at 30 µg, Streptomycin (SSTH) at 10 µg, Tetracycline (TCY) at 30 µg, and Gentamicin (GEN) at 10 µg, all tested on Muller-Hinton agar medium.
3.3.3 Trang thiết bị và dụng cụ a Trang thiết bị
Cân điện tử, máy dập mẫu, buồng cấy, nồi hấp, tủ ấm, tủ sấy, tủ lạnh, máy Vortex b Dụng cụ
Ttúi PE vô trùng, hộp giữ lạnh, dao, kéo, kẹp, đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, cốc đong, ống đong, pipet, que cấy…
Phương pháp nghiên cứu
Chúng tôi đã tiến hành điều tra hiện trạng phân phối thịt lợn tại quận Long Biên thông qua việc phỏng vấn trực tiếp người bán thịt lợn theo bảng câu hỏi đã được chuẩn bị sẵn.
3.4.2 Phương pháp thu thập mẫu
Mẫu thịt được thu thập ngẫu nhiên từ các quầy bán thịt tại chợ ở quận Long Biên, Hà Nội, theo tiêu chuẩn TCVN 4833 – 1:2002 và TCVN 4833 – 2:2002 Sau khi lấy mẫu, thịt được đựng trong hộp vô trùng, bảo quản lạnh và vận chuyển về phòng thí nghiệm để đảm bảo chất lượng và độ an toàn.
3.4.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn E coli và Salmonella
3.4.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn E coli
Qui trình định lượng E coli (cfu/g) bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch Macconkey Theo TCVN 4833 – 2:2002
1/ Cân 10 g thịt mẫu, cắt nhỏ mẫu chứa trong túi dập mẫu Bổ sung 90ml dung dịch Pepton và nghiền nhỏ bằng máy nghiền mẫu
2/ Pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , … 10 -8 bằng cách hút
1ml dung dịch từ túi mẫu nghiền sang ống thủy tinh chứa 9ml dung dịch Peptop
3/ Cấy lỏng 100àl dung dich pha loóng trờn đĩa thạch Mac (mỗi nồng độ cấy 2 đĩa), Nuôi tủ ấm 37 º C/ 24h
4/ Đếm các khuẩn lạc có màu hồng cánh sen trên đĩa thạch Chọn 2 nồng độ pha loãng liền nhau có số khuẩn lạc đếm được trên mỗi đĩa ≤ 250 để đếm số lượng khuẩn lạc trên mỗi đĩa và tính toán kết quả theo công thức sau:
N: là số tế bào vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu
∑ : là tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa đã chọn.
1 : là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ 1
1 : là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ 2 d : là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất
3.4.3.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn Salmonella
Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi Phương pháp phát hiện
Salmonella trên đĩa thạch TCVN 4829 : 2005 (ISO 6579 : 2002)
Cân 25g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 225 ml dung dịch BPW và đồng nhất bằng Stomacher trong 2 phút Ủ ở 37 º C trong 18-24 giờ
Bước 2: Tăng sinh chọn lọc
Lắc để trộn đều dịch tăng sinh và chuyển 0,1 ml sang ống chứa 10 ml môi trường tăng sinh Rappaport-Vassliadis Soya Pepton (RV) đã được ủ ấm đến
Để tiến hành quá trình ủ, đầu tiên cần duy trì nhiệt độ ở 42 ºC trong khoảng 18-24 giờ, có thể kéo dài thêm 24 giờ nếu cần thiết Sau đó, chuyển 0,1 ml dịch tăng sinh vào ống chứa 1 ml Muller Kauffmann tetrathionat và ủ ở 37 ºC trong 24 giờ.
Bước 3: Phân lập và nhận diện
Sau khi chuyển mẫu từ môi trường Rappaport–Vassiliadis Soya Pepton sang môi trường BGA và ủ ở 37 ºC trong 24 giờ, kết quả cho thấy khuẩn lạc có màu đỏ hồng, hình dạng tròn bóng và lồi Tiếp theo, mẫu từ môi trường Muller Kauffmann ria được cấy sang môi trường XLT4, cũng ủ ở 37 ºC trong 24 giờ, cho kết quả khuẩn lạc có màu đen, tròn bóng và lồi Bước 4: Khẳng định.
Thử nghiệm H2S với Salmonella cho thấy vi khuẩn này chỉ lên men đường glucose, dẫn đến màu đỏ ở phần thạch nghiêng và màu vàng ở phần sâu Hầu hết các dòng Salmonella có khả năng sinh H2S, tạo ra các vệt màu đen trong môi trường Ngoài ra, vi khuẩn sinh hơi có thể làm rạn nứt thạch hoặc đẩy môi trường lên, tạo ra khoảng không dưới đáy ống nghiệm.
Thử nghiệm urea cho thấy Salmonella không phân giải ure, do đó không làm thay đổi pH của môi trường Sau khi nuôi cấy, môi trường canh thang ure vẫn giữ nguyên màu vàng cam.
Thử nghiệm Indol được thực hiện bằng cách cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa 5ml môi trường Tryptophan và ủ ở 37 ºC trong 24 giờ Sau thời gian ủ, nhỏ 1 giọt thuốc thử Kovac’s vào ống Nếu xuất hiện vòng màu đỏ, phản ứng là dương tính; ngược lại, nếu vòng màu nâu vàng xuất hiện, phản ứng là âm tính.
3.4.3.3 Phương pháp kháng sinh đồ
Phương pháp Bauer - Kirby, được mô tả bởi Carter và Cole năm 1990, được sử dụng để đánh giá tính mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn trong thí nghiệm này Kết quả thử khả năng mẫn cảm của vi khuẩn với các loại kháng sinh được đánh giá dựa trên bảng kết quả M100-S24 theo Wayne (2014) Vi khuẩn được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm và cấy vào môi trường thạch ống nghiêng NA (Nutrient agar) ở 37ºC trong 24 giờ Sau đó, sinh khối vi khuẩn được hòa trộn với 9 ml dung dịch NaCl 0,9% vô trùng, điều chỉnh đến độ đục Mc Farland 0,5 Huyễn dịch vi khuẩn được trải đều trên bề mặt đĩa thạch Muller – Hinton (MH) và đặt 5-6 khoanh giấy tẩm kháng sinh lên bề mặt đĩa thạch đã được chuẩn bị, sau đó ủ ở 37ºC trong 18-24 giờ.
Các bước tiến hành như sau:
-Bước 1: chuẩn bị môi trường thạch Muller – Hinton
-Bước 2: các chủng vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường thích hợp được dàn đều lên môi trường thạch đĩa Muller – Hinton
-Bước 3: giấy tẩm kháng sinh được đặt khoảng cách đều nhau trong đĩa
-Bước 4: nuôi dư để đánh giá mức độ nhảy
Kết quả được đọc mẫn cảm hay đề kháng c
M100-S2 yêu cầu nuôi cấy vi khuẩn ở 37ºC trong 18-24 giờ để đo đường kính vùng nhạy cảm hoặc kháng kháng sinh trên môi trường thạch Mueller Kết quả được xác định bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn quanh vi khuẩn khi tiếp xúc với kháng sinh tương ứng, từ đó đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn đối với một số loại kháng sinh.
Lượng ks (àg) Đườn vô k
COL 10 14 azole/trimethoprim STX 25 10 usceptible): mẫn cảm cao ntermediate): mẫn cảm trung bình Resistant): Kháng
S24: Tiêu chuẩn thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh t ng kính vòng vô khuẩn khuẩn
Mueller-Hinton ẩn để xác định tính ng tại bảng 3.1 áng sinh của vi khuẩn ờng kính vòng vô khuẩn (mm)
Trong nghiên cứu này, các loại kháng sinh được lựa chọn để kiểm tra khả năng mẫn cảm của vi khuẩn E coli và Salmonella dựa trên tiêu chuẩn quốc tế về danh mục kháng sinh cần kiểm soát đối với vi khuẩn kháng thuốc.
3.4.3.5 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm Excel 2010
Trong đó: : Số trung bình xi: Số hạng thứ i n: Dung lượng mẫu
Sai số trung bình: m = ± √ # $ (Với n≥ 30)
