Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu
- Giống vi sinh vật: Nấm rễ Mycorrhizae
- Chế phẩm sinh học dùng để cải tạo đất nhiễm mặn.
Phạm vi nghiên cứu
- Địa điểm nghiên cứu: Học viện Nông Nghiệp Việt Nam
- Cây trồng thí nghiệm chậu vại: Cây đậu đũa (Tên khoa học là Vigna unguiculata subsp Sesquipedalis)
- Đất thí nghiệm: Phù sa sông Hồng được nhiễm mặn nhân tạo
- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 9 năm 2018 đến tháng 8 năm 2019
Nội dung nghiên cứu
- Đặc điểm của các chủng vi sinh vật dùng để sản xuất chế phẩm sinh học cải tạo đất nhiễm mặn
- Lựa chọn nguyên liệu để sản xuất chế phẩm
- Chất lượng chế phẩm sinh học để cải tạo đất nhiễm mặn
- Đánh giá hiệu quả cải tạo đất nhiễm mặn bằng chế phẩm sinh học.
Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp thu thập số liệu thứ cấp
- Thu thập số liệu từ các nguồn báo chí, internet, bài báo khoa học trong nước và quốc tế
- Kế thừa có chọn lọc từ những tài tiệu và nghiên cứu của các nhà khoa học có liên quan đến nghiên cứu
3.4.2 Phương pháp thu nhận bào tử từ vùng nấm rễ của cậy trồng theo phương pháp sang ướt cải tiến
Mẫu đất được lấy từ vùng rễ ở độ sâu khoảng 15-20cm và hòa vào 1 lít nước Sau khi khuấy đều, cần loại bỏ tàn dư thực vật và bóp nhỏ các cục đất lớn Tiến hành lắng trong 20 giây trước khi đổ dung dịch qua bộ sàng với các kích cỡ lỗ lần lượt là 1.000 µm, 500 µm, 200 µm, 100 µm, và 50 µm Quá trình này sẽ được lặp lại để đảm bảo độ chính xác trong phân tích.
Sau ba lần thực hiện, các thành phần còn lại được chuyển sang đĩa petri Sử dụng kính hiển vi soi nổi, chúng ta quan sát và thu thập bào tử nấm rễ từ đĩa petri, sau đó bảo quản bào tử trong nước vô trùng ở nhiệt độ 4 độ C.
Quan sát hình thái, màu sắc và kích thước của bào tử nấm rễ được thực hiện thông qua phương pháp quan sát và đo trực tiếp bằng kính hiển vi soi nổi Kết quả sẽ được so sánh với khóa phân loại của Franke và Morton (1994) để xác định chính xác loại bào tử.
- Xác định hình thái và kích thước của bào tử: bảng so sánh của Morton
- Màu sắc của bào tử: Xác định bằng bảng màu chuẩn 4 nhân tố CMYB (Cyan/ Mangenta/ Yellow/ Black) (theo INVAM)
- Số lượng bào tử: Xác định bằng phương pháp đếm trực tiếp (Brundrett Mart et al.)
3.4.3 Phương pháp đánh giá đặc tính sinh học của nấm rễ Đánh giá đặc tính sinh học của các chủng giống nấm rễ bằng cách xác định tỷ lệ nảy mầm, sự phát triển của hệ sợi và quá trình sinh trưởng của bào tử nấm rễ trong dung dịch chiết đất Dung dịch sinh dưỡng được chiết theo tỷ lệ 1:10, phân vào các ô của hộp nuôi cấy bằng plastic (2ml/ô) Bào tử nấm ễ được khử trùng bề mặt bằng Chloramin T và Streptomycin rồi rửa sạch bằng nước vô trùng trước khi nuôi cấy trong dung dịch chiết ( 1 bào tử/ô, theo dõi 10 bào tử/ giống) trong điều kiện tối ở 25 oC Sau 15, 30 ngày nuôi cấy, xác định số lượng bào tử theo các giao đoạn sinh trưởng khác nhau, sự phát triển của hệ sợi nấm và sự nảy mầm của bào tử nấm rễ ( Nguyễn Thị Minh và cs., 2005,2014) Đặc tính đánh giá:
- Theo dõi quá trình sinh trưởng của bào tử trên dịch chiết đất có độ mặn khác nhau, theo 4 cấp độ:
Giai đoạn ban đầu (Kiểu A): Chưa hình thành sợi
Giai đoạn 2 (Kiểu B): Hình thành 1 sợi ngắn
Giai đoạn phát triển (Kiểu C): Sợi nấm bắt đầu phân nhánh
Giai đoạn trưởng thành (Kiểu D): Sợi nấm phân nhiều nhánh, hình thành cấu trúc đặc trưng
Nghiên cứu xác định tỷ lệ nảy mầm và sự phát triển của hệ sợi nấm rễ trên dịch chiết đất với các mức độ mặn khác nhau, nhằm phân tích quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm Thí nghiệm được thực hiện với ba mức độ mặn, cung cấp cái nhìn sâu sắc về ảnh hưởng của độ mặn đến sự phát triển của nấm rễ.
Phát triển nhẹ (Mức 1): Bào tử phát triển một vài sợi
Phát triển vừa phải (Mức 2): Số lượng sợi nấm phát triển trung bình
Phát triển mạnh (Mức 3): Sợi nấm sinh trưởng mạnh tới mức tối đa với nhiều cấu trúc đặc trưng (Nguyễn Thị Minh và cs.,2014)
3.4.4 Đánh giá khả năng cộng sinh trên cây chủ của các chủng giống nấm rễ
Khả năng cộng sinh của nấm rễ được đánh giá bằng phương pháp xử lý AM trên cây chủ thông qua thí nghiệm chậu vại theo cách của Vincent (1976) Thí nghiệm này được thực hiện ba lần nhắc lại trong chậu đất vô trùng với trọng lượng 100g.
Hạt giống cây đậu đỗ được khử trùng bằng dung dịch NaClO 10%, sau đó được rửa sạch bằng nước cất Tiếp theo, hạt giống được cho nảy mầm trên giấy lọc ẩm trong đĩa petri vô trùng.
Sau khi hạt nảy mầm và phát triển rễ khoảng 2 – 3 cm ở nhiệt độ 25 o C, cây con sẽ được chuyển vào chậu đất vô trùng với tỷ lệ 3 cây/100g đất Đất được chuẩn bị bằng cách sàng qua rây 2 mm và khử trùng hai lần ở 80 o C trước khi sử dụng Bào tử AM sẽ được nhiễm vào hệ rễ của cây chủ với tỷ lệ 10 bào tử/chậu Sau 30 ngày xử lý nấm rễ ở nhiệt độ 25 o C và ánh sáng 12 giờ/ngày, các chỉ tiêu sinh trưởng của nấm rễ sẽ được xác định, bao gồm chiều cao cây, chiều dài rễ, trọng lượng than tươi và trọng lượng rễ tươi.
Để xác định tỷ lệ xâm chiếm của nấm rễ vào rễ cây chủ, chúng tôi áp dụng phương pháp phóng đại ô giao nhau của McGonige (1990) Đồng thời, chúng tôi cũng tiến hành đếm số lượng bào tử được tạo thành từ thí nghiệm chậu vại.
Rễ cây được làm sạch và nhuộm bằng Tryphan Blue, sau đó quan sát dưới kính hiển vi để xác định các cấu trúc đặc trưng của nấm AM trong tổ chức rễ Đồng thời, chiều dài của rễ có cấu trúc AM và tổng chiều dài rễ được đo để tính toán tỷ lệ xâm nhiễm của nấm vào rễ cây.
Công thức tính: Độ dài rễ có cấu trúc AM × 100 (%) Tổng chiều dài rễ
3.4.5 Phương pháp lựa chọn cây chủ để nhân giống:
Lựa chọn cây chủ nhân giống nấm rễ cần thực hiện phương pháp xử lý giống vi sinh vật trực tiếp cho cây con, nuôi trong điều kiện 25°C với chu kỳ ánh sáng 12 giờ Các chỉ tiêu đánh giá bao gồm số lượng bào tử, tỷ lệ xâm chiếm của rễ cây và sự phát triển sinh trưởng của cây Có thể áp dụng nhân giống nấm rễ theo phương pháp in vivo hoặc in vitro để đạt hiệu quả cao nhất.
3.4.6 Phương pháp sản xuất và đánh giá chất lượng của chế phẩm sinh học
+ Chế phẩm sản xuất theo quy trình của Nguyễn Thị Minh và cs (2014) + Đánh giá chất lượng của chế phẩm sinh học
Dựa trên khả năng sinh trưởng của nấm rễ và tính chất dinh dưỡng của đất phù sa, loại đất này được chọn làm chất nền cho sản xuất chế phẩm sinh học Công thức chế phẩm bao gồm 1kg đất (rây qua rây 2mm), 2000 bào tử nấm rễ với mật độ 200 bào tử/100g đất, và bổ sung phân bón NPK (2,6g Ure và 2g KCl) Độ ẩm của chế phẩm duy trì trong khoảng 20 - 25% Chất lượng chế phẩm được đánh giá qua các chỉ tiêu như pH, độ ẩm và hàm lượng Nitơ tổng số.
Bảng 3.1 Phương pháp xác định chất lượng chế phẩm sinh học Đặc tính Phương pháp TCVN pH Đo bằng pH meter 1867:2001
Nito tống số Phương pháp Kjeldahl cải biên 6498:1999
K 2 O% Phương pháp xác định Kali tổng số 4402: 1987
VSV tạp (CFU/ml) Phương pháp pha loãng Koch
Số lượng bào tử nấm rễ Phương pháp đếm Brundrett Mart Độ ẩm Phương pháp sấy khô 9297:2012
P 2 O 5 (mg/100g đất) Phương pháp Pniani 8661:2011
K 2 o 5 (mg/100g đất) Phương pháp Maxlova 8560:2010
3.4.7 Phương pháp bố trí thí nghiệm để đánh giá hiệu quả chế phẩm sinh học
Thí nghiệm chậu vại nhằm đánh giá hiệu quả của chế phẩm sinh học theo phương pháp Vincent (1976) được thực hiện với 7 công thức, mỗi công thức được lặp lại 5 lần và trồng 3 cây trong mỗi chậu Mỗi chậu thí nghiệm chứa 5kg đất.
Thí nghiệm chậu vại được thực hiện để đánh giá hiệu quả của công nghệ sinh học (CPSH) trên cây trồng trong điều kiện đất nhiễm mặn nhân tạo, với nồng độ muối từ 0,5% đến 1,5% Nghiên cứu bao gồm 7 công thức khác nhau, mỗi công thức được lặp lại 5 lần, với mỗi chậu trồng 3 cây trong 5 kg đất.
+ CT1, CT2, CT4, CT6 – Các công thức đối chứng: Bổ sung dinh dưỡng tương ứng với lượng bón thâm canh Dựa trên kết quả phân tích tính chất của
Sau khi phối trộn CPSH, lượng dinh dưỡng cần bổ sung cho mỗi chậu thí nghiệm CT1, CT2, CT4, CT6 được tính toán là 3,28g Ure, 2,175g KCl và 2,448g Ca(H2PO4)2.
+ CT3, CT5, CT7 – Các công thức sử dụng chế phẩm nấm rễ: Bổ sung thêm dinh dưỡng 2,965g Ure và 2,178g Ca(H2PO4)2
+ Các công thức sử dụng chế phẩm từ nấm rễ (10ml chế phẩm pha với 50 ml nước sạch) bón 10ml/ chậu từ lúc cây ra lá thật
Bảng 3.2.Các công thức thí nghiệm
STT Công thức Ký hiệu Độ mặn (Tổng số muối tan %)
1 Công thức 1 CT1 0,02 Không sử dụng chế phẩm
2 Công thức 2 CT2 0,5 Không sử dụng chế phẩm
3 Công thức 3 CT3 0,5 Sử dụng chế phẩm
4 Công thức 4 CT4 1,0 Không sử dụng chế phẩm
5 Công thức 5 CT5 1,0 Sử dụng chế phẩm
6 Công thức 6 CT6 1,5 Không sử dụng chế phẩm
7 Công thức 7 CT7 1,5 Sử dụng chế phẩm
+ Các chỉ tiêu theo sinh trưởng và phát triển cây: Chiều cao cây, chiều dài rễ, số lượng quả, diện tích lá, tỷ lệ sâu bệnh
- Đánh giá tính chất của đất trước và sau khi thí nghiệm
Bảng 3.3 Các chỉ tiêu đánh giá đất trồng
Chỉ tiêu Phương pháp Tiêu chuẩn pH Đo bằng pH meter Độ ẩm Phương pháp sấy khô TCVN 4048:2011
OC (%) Phương pháp Walkley - Black TCVN 9294:2012
K TS (%) Phương pháp quang kế ngọn lửa TCVN 8660:2011
P TS (%) Phương pháp Xanh Molipden TCVN 4052:1985
P 2 O 5 (mg/100g đất) Phương pháp Oniani TCVN 8661:2011
K 2 O (mg/100g đất) Phương pháp Maxlova TCVN 8560:2010 VSV hữu ích (CFU/ml) Phương pháp pha loãng Koch
+ Đánh giá độ mặn: Để đánh giá độ mặn, những phương pháp thường dùng là:
Phương pháp xử lý số liệu
- Sử dụng phần mềm Excel
- Sử dụng phần mềm xử lý thống kê IRRISTAT 5.0
Kết quả nghiên cứu
Đặc điểm của các chủng vi sinh vật có tuyển chọn làm giống sản xuất chế phẩm
4.1.1 Đặc điểm hình thái học của các chủng nấm rễ cộng sinh Để tuyển chọn được các chủng nấm rễ cộng sinh có đặc tính sinh học cao sản xuất chế phẩm sinh học để cải tạo đất bị nhiễm mặn cần phải đánh giá chỉ tiêu khả năng chịu mặn cao và thích nghi tốt với điều kiện môi trường Các giống
Các cây bản địa thường có khả năng thích nghi tốt với điều kiện môi trường địa phương, không cần thời gian để thích nghi, do đó chúng có sức sống mạnh mẽ và ít bị suy thoái.
Bài viết này trình bày việc quan sát và so sánh đặc điểm hình thái học của 12 chủng nấm rễ bản địa, được phân lập từ đất vùng rễ của các cây họ thảo như mần trâu và cây cỏ đuôi phụng Những chủng nấm này được lấy từ Bộ môn vi sinh, khoa Môi trường, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, từ đất phù sa cổ tại xã Tri Phương, huyện Tiên Du, tỉnh Bắc Ninh và đất nhiễm mặn tại Nam Định Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái học của các bào tử nấm rễ được trình bày chi tiết trong bảng 4.1.
Phân loại sơ bộ các chủng nấm rễ cộng sinh đã phân lập theo hệ thống của Franke và Morton (1994) thì 12 chủng phân lập được gồm có:
- 6 chủng thuộc giống Gigaspora gồm Gigaspora decipiens, Gigaspora albida và 4 chủng giống còn lại được ký hiệu từ Gigaspora sp1 đến Gigaspora sp4
- 2 chủng thuộc giống Acaulospora được ký hiệu là Acaulospora sp1 và
- 1 chủng thuộc giống Glomus được ký hiệu Glomus sp1
- 2 chủng thuộc giống Scutellospora được ký hiệu từ Scutellospora sp1 đến Scutellospora sp2
- 1 chủng thuộc giống Dentiscutata nigra
Kết quả bảng 4.1 cũng cho thấy:
Bào tử nấm rễ AM có hình thái, màu sắc và kích thước rất đa dạng, với sự khác biệt rõ rệt giữa các chủng giống khác nhau Hầu hết bào tử có hình dạng hình cầu hoặc gần hình cầu, màu sắc phong phú và kích thước dao động từ 85 đến 430 µm.
Bảng 4.1 trình bày hình thái học và phân loại các chủng nấm rễ AM, bao gồm các ký hiệu, địa điểm lấy mẫu, hình dạng, màu sắc và kích thước Các chủng nấm như Gigaspora spp., Acaulospora spp., và Scutellospora spp được mô tả với các đặc điểm hình thái cụ thể, từ màu sắc như vàng, trắng đến đen, cùng với kích thước khác nhau Nấm rễ AM có vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, hỗ trợ cây trồng hấp thụ dinh dưỡng và nước Việc phân loại chính xác các chủng nấm này giúp nghiên cứu và ứng dụng trong nông nghiệp bền vững.
Các chủng nấm rễ có sự phân bố đa dạng, với những giống nấm rễ cộng sinh có khả năng phân bố trên nhiều loại đất khác nhau thường có khả năng sống sót và thích nghi với môi trường tốt hơn.
Kết quả nghiên cứu này tương đồng với các phát hiện của Nguyễn Thị Minh trong các năm 2005, 2007 và 2014, liên quan đến đặc điểm hình thái và kích thước của các chủng nấm rễ được phân lập ở vùng đất phù sa đồng bằng sông Hồng.
4.1.2 Khả năng sinh trưởng của bào tử nấm rễ cộng sinh
Nghiên cứu khả năng sinh trưởng của bào tử nấm rễ cho thấy rằng các chủng có tốc độ sinh trưởng nhanh và mạnh sẽ có sức sống cao, khả năng hấp thụ và vận chuyển dinh dưỡng tốt, từ đó thúc đẩy sự phát triển của cây trồng, đặc biệt trong điều kiện đất nhiễm mặn và thiếu nước Đây là một trong những tiêu chí quan trọng để đánh giá và tuyển chọn các giống nấm rễ có sức sống cao nhằm sản xuất chế phẩm phục hồi đất bị nhiễm mặn Các đặc tính sinh học chủ yếu được xem xét bao gồm quá trình sinh trưởng của bào tử, sự phát triển của hệ sợi nấm và tỷ lệ nảy mầm.
* Sự sinh trưởng của bào tử nấm rễ cộng sinh
+ Trên dịch chiết đất có độ mặn 0,5%
Hình 4.1 Số lượng bào tử sau 15 ngày và 30 ngày nuôi cấy ở độ mặn 0,5%
Sau 15 ngày đa số bào tử ở giai đoạn đầu của thời kỳ phát triển và chưa hình thành sợi (kiểu A); một số đã chuyển sang giai đoạn hình thành sợi ngắn (kiểu B) và sợi nấm bắt đầu phân nhánh (kiểu C); có khá nhiều bào tử ở giai đoạn sinh trưởng (kiểu D) như chủng A1 (Gigaspora sp1), AMQ3 (Acaulospora sp2),
AM2 (Gigaspora sp4), AM3 (Dentiscutata nigra), …
- Chủng bào tử có số lượng ở giai đoạn D nhiều và sinh trưởng mạnh, chủng bào tử ở giai đoạn A là những chủng sinh trưởng yếu
Chủng AM2 và AM3 là những loại phát triển mạnh và nhanh nhất, với số lượng bào tử ở kiểu D chiếm ưu thế Cụ thể, chủng AM2 chiếm 5/10 bào tử, trong khi chủng AM3 chiếm 4/10 bào tử.
Các chủng sinh trưởng yếu nhất bao gồm A3, A4, A6 và AMQ2, trong đó chủng A3 chiếm 6/10 bào tử, A4 chiếm 5/10 bào tử, A6 cũng chiếm 6/10 bào tử và AMQ2 chiếm 5/10 bào tử Số lượng bào tử lớn nhất tập trung ở kiểu A.
- Sau 30 ngày nuôi cấy, hầu hết các bào tử chuyển sang giai đoạn sinh trưởng kiểu D, nhiều bào tử sinh trưởng chậm vẫn ở giai đoạn sinh trưởng kiểu
A, B Số lượng bào tử ở giai đoạn kiểu C tăng lên
Các chủng sinh trưởng mạnh nhất gồm: AMQ1, AMQ3, AM1, AM2 và AM3 Các chủng này có hầu hết bào tử đang ở giai đoạn sinh trưởng mạnh kiểu
D, rất ít bào tử ở kiểu A Đặc biệt chủng AM3 có tới 6/10 bào tử ở kiểu D, chủng AM2 và chủng AMQ3 có 5/10 bào tử ở kiểu D
Chủng A4 sinh trưởng yếu nhất chỉ có 2/10 bào tử ở giai đoạn sinh trưởng kiểu D
+ Trên dịch chiết đất có độ mặn 1%
Hình 4.2 Số lượng bào tử sau 15 ngày và 30 ngày nuôi cấy ở độ mặn 1%
Sau 15 ngày nuôi cấy, hầu hết các chủng vi sinh vật đều phát triển ở giai đoạn kiểu A Một số bào tử đã tiến triển sang giai đoạn kiểu B và kiểu C, trong khi một số ít chủng như AM3, AM2, AM, AMQ3 đã chuyển sang giai đoạn kiểu D.
Chủng AM3 là chủng phát triển nhanh và mạnh nhất Tiếp theo là đến các chủng AMQ3, AM2,…
Chủng A4, chủng A3 và chủng A6 sinh trưởng yếu nhất Cả 2 chủng A3, A6 đều không có bào tử nào ở giai đoạn kiểu D, 5/10 bào tử ở giai đoạn kiểu
A Chủng A4 có 1/10 bào tử ở giai đoạn kiểu D, 7/10 bào tử ở giai đoạn kiểu A
Sau 15 ngày, bào tử ở độ mặn 0,5% cho thấy chủng AM3 và AM2 là những chủng phát triển nhanh và mạnh nhất, trong khi các chủng A3 và A6 có sự sinh trưởng yếu nhất.
- Sau 30 ngày nuôi cấy, hầu hết các bào tử chuyển sang giai đoạn kiểu B và kiểu C
Các chủng sinh trưởng mạnh gồm: AM3, AMQ3, AMQ1 đều có 4/10 bào tử ở giai đoạn kiểu D và AM1, AM2 có 3/10 bào tử ở giai đoạn kiểu D
Chủng A4, A1, A6, A3sinh trưởng yếu nhất chỉ có1/10 bào tử ở giai đoạn sinh trưởng kiểu D
Sau 30 ngày ở độ mặn 0,5%, sự sinh trưởng của bào tử cho thấy có sự chuyển dịch nhỏ trong thứ tự sắp xếp.
A4 < A1 < A6 < A3< A5
