Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu
Virus cúm A/H9N2 đã được phát hiện trong các mẫu dịch ngoáy hầu họng của gà và các mẫu môi trường như phân tươi, chất thải trên chuồng và lồng nhốt gia cầm, cũng như tại khu vực giết mổ và khu vực chứa rác thải.
Đã tiến hành lẫy mẫu tại 5 chợ buôn bán gia cầm sống ở tỉnh Bắc Ninh, bao gồm các chợ Thị Cầu, Chợ Đọ, và Chợ Gà, cùng với 2 chợ ở thành phố Hà Nội là chợ Hà Vỹ và chợ Ngũ Hiệp.
Các chợ được chọn dựa trên kết quả dương tính với virus cúm gia cầm từ Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương và Cục Thú y trong chương trình giám sát cúm gia cầm do FAO tài trợ Mỗi chợ phải có hoạt động buôn bán gia cầm sống liên tục 7 ngày trong tuần và có ít nhất 10 hộ cá thể tham gia.
Thực hiện lấy mẫu và xử lý, xét nghiệm mẫu từ tháng 10/2017 đến tháng 3/2018.
Nội dung nghiên cứu
(i) Tình hình chăn nuôi, tiêm phòng và dịch bệnh cúm gia cầm tại Hà Nội và Bắc Ninh giai đoạn 2015 - 2018
(ii) Giám sát lưu hành virus cúm A/H9N2 tại các chợ
- Xác định tỷ lệ nhiễm virus cúm type A trong các mẫu
- Xác định tỷ lệ nhiễm virus cúm subtype H9 trong các mẫu
- Xác định sự lưu hành virus cúm A/H9N2 tại các chợ lấy mẫu
(iii) Thu nhận, giải trình tự gen mã hóa cho kháng nguyên HA, NA của một số chủng dương tính cúm A/H9N2
- Phân tích, so sánh sự tương đồng về nucleotide của gen HA và NA với chủng tham chiếu;
- Xác định mối quan hệ phả hệ của chủng nghiên cứu với chủng tham chiếu và các chủng đăng ký trong ngân hàng gen
(iv) Đánh giá một số yếu tố nguy cơ có ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm virus cúm A tại địa bàn nghiên cứu.
Nguyên liệu
Mẫu dịch ngoáy hầu họng của gà và mẫu môi trường tại 05 chợ đã được lựa chọn
3.3.2 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất lấy mẫu
3.3.2.1 Dụng cụ, trang thiết bị
- Máy Realtime PCR: Biorad IQ5
- Máy ly tâm lạnh ZK306, máy ly tâm lạnh Hettick
- Buồng cấy an toàn sinh học cấp II -ESCO
- Buồng cấy an toàn sinh học cấp I
- Máy triết tách mẫu tự động TACO
- Micropipet các cỡ, Multisepper và đầu típ phù hợp; ống eppendorf có thể tích khác nhau
Trong lĩnh vực bảo hộ lao động, việc sử dụng các sản phẩm như tăm bông vô trùng, ống đựng mẫu, thùng bảo quản mẫu, nhãn dán mẫu, phiếu ghi thông tin, túi đựng mẫu, thuốc sát trùng và găng tay là vô cùng quan trọng Những vật dụng này không chỉ đảm bảo an toàn cho người lao động mà còn giúp duy trì chất lượng và độ chính xác của các mẫu trong quá trình làm việc Sự kết hợp của các sản phẩm này là cần thiết để đảm bảo quy trình làm việc hiệu quả và an toàn.
- Môi trường bảo quản mẫu: Môi trường PBS - Glycerol, được pha theo công thức sau:
+ Pha hỗn hợp PBS và Glycerol theo tỷ lệ 1:1
+ Bổ sung kháng sinh vào 1l môi trường PBS/Glycerol
Benzylpenicillin: 2*106IU/l Streptomycine: 200mg/l Gentamycine: 250mg/l Kiểm tra PH khoảng 7,4, chuyển 3ml vào ống 15ml, bảo quản ở 4 0 C
- Bộ kít chiết tách TACO DNA/RNA EXTRACTION KIT
- Bộ kít dùng cho phản ứng realtime RT-PCR: SuperScript III One step qRT-PCR (Cat No.11732-020)
- Bộ kít dùng cho phản ứng RT-PCR: SuperScript III One step RT-PCR (Cat No 12574-026)
- Cồn Ethanol tuyệt đối-Merk
- Đối chứng dương tính (+), đối chứng âm tính (-) H9N2
- Đoạn mồi (primers) và Đoạn dò (probe) để phát hiện virus,
- Đoạn mồi dùng để giải trình tự gen HA
Bảng 3.1 Trình tự đoạn mồi và đoạn dò để phát hiện virus H9N2
Kí hiệu probe/primers Trình tự (5'-3')
Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp dịch tễ học mô tả, dịch tễ học phân tích
Nghiên cứu sử dụng phương pháp điều tra hồi cứu (Nguyễn Như Thanh, 2015) nhằm phân tích tình hình chăn nuôi gia cầm, diễn biến dịch cúm gia cầm và thực trạng công tác tiêm phòng cúm gia cầm tại thành phố Hà Nội và tỉnh Bắc Ninh trong giai đoạn 2015.
Phương pháp phỏng vấn trực tiếp các chủ gia cầm được thực hiện thông qua bảng câu hỏi đã được thiết kế sẵn, nhằm thu thập thông tin về tình hình buôn bán gia cầm gần đây Mỗi bảng câu hỏi từ các hộ buôn bán sẽ được lưu trữ theo mã thống nhất, tương ứng với mẫu được chọn.
Mẫu bệnh phẩm cần được lấy, bao gói và bảo quản theo Quy chuẩn Việt Nam QCVN 01 - 83: 2011/BNNPTNT, được ban hành theo Thông tư số 71/2011/TT-BNNPTNT ngày 25/10/2011 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn.
3.4.2.1 Phương pháp lấy mẫu dịch ngoáy hầu họng
Dùng tăm bông vô trùng đưa sâu vào trong hầu họng của gà ngoáy nhẹ nhàng trên bề mặt niêm mạc
Mẫu được thu thập liên tục trong 7 ngày tại mỗi chợ, chọn 10 hộ bán gia cầm đầu tiên có tối thiểu 5 gà/hộ Mẫu được lấy từ dịch ngoáy hầu họng của 5 gà, được tính là 1 mẫu gộp của hộ đó Quy trình gộp mẫu diễn ra ngay tại chợ, trong ống chứa 2 ml dung dịch nuôi, sau đó được bảo quản lạnh trong thùng.
4 0 C rồi vận chuyển về phòng thí nghiệm tại NCVD, lưu giữ ở -70 0 C cho các bước thí nghiệm tiếp theo
3.4.2.2 Phương pháp lấy mẫu môi trường
Mẫu môi trường được thu thập bằng cách sử dụng tăm bông vô trùng tại ba khu vực khác nhau, liên quan đến hoạt động mua bán và giết mổ gia cầm.
Các vị trí lấy mẫu môi trường được đề xuất bởi Indriani et al (2010) nhằm phục vụ cho chương trình quản lý định kỳ và giám sát sự lây lan của cúm gia cầm tại các chợ buôn bán gia cầm sống.
- Khu vực nhốt gia cầm (bao gồm chuồng, lồng… nhốt, chứa gia cầm trong thời gian diễn ra hoạt động buôn bán)
- Khu vực diễn ra hoạt động giết mổ (bao gồm cả dụng cụ giết mổ);
- Khu vực chứa chất thải (bao gồm thùng rác chứa lông và các phần bỏ đi khác sau giết mổ);
Mỗi ngày, ba mẫu môi trường được lấy riêng từ 3 khu vực được đề cập trên và được tính thành 1 mẫu gộp của chợ đó trong 1 ngày
Mẫu được bảo quản trong dung dịch nuôi và được vận chuyển lạnh về NCVD, Hà Nội Mẫu được lưu giữ ở -70 0 C cho các bước thí nghiệm tiếp theo
3.4.3 Phương pháp xét nghiệm virus cúm A/H9N2
Phương pháp xét nghiệm virus cúm A/H9N2 sử dụng kỹ thuật Realtime RT-qPCR được thực hiện theo quy trình chẩn đoán bệnh Cúm gia cầm theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8400-26:2014, bao gồm các bước tóm tắt như sau:
- Xử lý mẫu bệnh phẩm:
- Triết tách RNA tổng số bằng máy tự động TACO
- Chuẩn bị Master mix theo tỷ lệ dưới đây:
(Kít Invitrogen Superscript 3 qRT-PCR Kit)
Lượng cho 01 phản ứng, àl
- Tiến hành nhân gen theo chu trình nhiệt sau:
Nhiệt độ Thời gian/chu kỳ
Chu trình nhiệt được tối ưu hóa theo hướng dẫn sử dụng của bộ kít (Cat No.11732-020)
Quy trình xét nghiệm mẫu thực hiện theo sơ đồ sau:
Hình 3.1 Quy Đọc kết quả Điều kiện phản ứ trước) có giá trị Ct (± 2 C
Với điều kiện như không có Ct là âm tính
Quy trình xét nghiệm virus cúm A được công nhận với mẫu đối chứng dương (± 2 Ct) Mẫu đối chứng âm tính không có giá trị Ct, trong khi mẫu có giá trị Ct ≤ 35 được coi là dương tính Mẫu có giá trị 35 < Ct ≤ 40 được xác định là nghi ngờ cúm A/H9N2, với giá trị Ct được chuẩn độ.
Những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại bằng phương pháp khác (phân lập virus) để khẳng định
3.4.4 Phương pháp giải trình tự và phân tích gen HA
Chúng tôi xác định biến đổi di truyền và nhánh virus cúm gia cầm type A/H9N2 lưu hành thông qua kỹ thuật giải trình tự và phân tích gene HA Để thực hiện việc này, chúng tôi sử dụng cặp primer đặc hiệu để khuếch đại đoạn gene HA bằng phương pháp RT-PCR, sử dụng bộ kit Invitrogen Superscript III Platinum One step qRT-PCR Kit - Mỹ, theo đúng quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất.
Kiểm tra kích thước sản phẩm khuếch đại bằng phương pháp điện di trên thạch 2% cho thấy sản phẩm khuếch đại của đoạn gene HA1 và HA2 lần lượt có kích thước 1100bp và 1000bp Các mẫu được chọn là những sản phẩm khuếch đại đoạn gen HA1 và HA2 đúng kích thước theo thiết kế, sau đó được gửi đi Công ty Macrogen, Hàn Quốc để thực hiện giải trình tự gen.
Chuỗi trình tự đoạn gene HA của virus cúm gia cầm type A/H9N2 đã được xử lý và phân tích bằng phần mềm MEGA 6.0 Quá trình này bao gồm việc liên kết và so sánh với các chủng tham chiếu từ ngân hàng gene thông qua chức năng ClustalW Đồng thời, phân nhóm virus cúm gia cầm type A/H9N2 được thực hiện bằng phương pháp kết nối liền kề với hệ số Bootstrap 1.000 lần lặp lại.
3.4.5 Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả xét nghiệm được nhập và xử lý qua MS Excel, phần mềm SAS 9.0, như sau:
- Phân tích các yếu tố nguy cơ: Theo phương pháp nghiên cứu bệnh - chứng (Nguyễn Như Thanh, 2015)
Sử dụng bảng tương liên (2x2) để phân tích
Có bệnh Không có bệnh Tổng
Tổng Cột 1 (C2) Cột 2 (C2) Tổng toàn bộ (T)
+ Tính tỷ suất chênh lệch OR (Odd Ratio):
OR = Trong đó chọn đối tượng quy định như sau:
+ Những mẫu dương tính với virus cúm A: Mẫu dương
Các mẫu âm tính với virus cúm A bao gồm: mẫu âm a cho nhóm bệnh có phơi nhiễm, mẫu âm b cho nhóm không bệnh nhưng có phơi nhiễm, mẫu âm c cho nhóm bệnh nhưng không phơi nhiễm, và mẫu âm d cho nhóm không bệnh và không phơi nhiễm.
Nếu OR (Odds ration) = 1: Không có ảnh hưởng, khác nhau giữa 2 nhóm + OR > 1: Nguy cơ tăng
+ OR
