(LUẬN văn THẠC sĩ) xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời omeprazole, lansoprazole, pantoprazole và rabeprazole trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC DAD)

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

Các hoạt chất OPZ, LPZ, PPZ và RPZ có trong huyết tương

Dung môi sử dụng cho sắc ký lỏng bao gồm acetonitril, methanol và nước, tất cả đều đạt chuẩn từ Merck, Đức Các hóa chất cần thiết như kali dihydrophosphat, kali hydroxyd, triethylamin, natri acetat và acid acetic cũng được cung cấp bởi Merck, Đức, đảm bảo tiêu chuẩn tinh khiết phân tích.

2.1.3 Chất đối chiếu, vật liệu nghiên cứu

Các chất đối chiếu được cung cấp bởi Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Thành Phố

Hồ Chí Minh, huyết tương người cung cấp bởi Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học Thành phố Hồ Chí Minh (số kiểm soát: 1620 16L19) được trình bày ở Bảng 2.1

Bảng 2.1 Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu

Hợp chất Số lô Hàm lượng Nơi cung cấp

Viện Kiểm nghiệm thuốc TPHCM

PPZ Natri QT219 030715 94,21 % RPZ Natri QT226 010813 96,29 %

2.1.4 Dụng cụ, máy móc, thiết bị

Dụng cụ: Các loại pipet, micropipet, bình định mức, các loại dụng cụ lấy mẫu: bơm tiêm, ống ly tâm, ống đựng huyết tương

Bảng 2.2 trình bày các thiết bị nghiên cứu, tất cả đều được hiệu chuẩn định kỳ theo quy định Các dụng cụ thủy tinh chính xác được sử dụng từ hãng Vitlab – Đức, đảm bảo đạt chuẩn chính xác cấp A.

Bảng 2.2 Thiết bị dùng trong nghiên cứu

Tên thiết bị Hãng sản xuất, xuất xứ Đầu dò dãy diod quang (1260 diod) Agilent, Mỹ

Cột sắc ký XDB Zobrax

Máy đo pH S220K Mettler Toledo, Thụy Sĩ

Cân phân tích 0,01 mg, max 120 g Mettler Toledo, Thụy Sĩ

Bể siêu âm gia nhiệt Power Sonic, Taiwan

Máy quang phổ UV 1800 Shimadzu, Nhật

Máy ly tâm Hermle Z306K Hermle Z336K, Đức

Máy lắc vortex S200 Labnet, Mỹ

Hệ thống lọc dung môi Rooker 400, Taiwan

Màng lọc PTFE 0,22 àm; 0,45 àm Sartorius, Đức

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Các dung dịch thử nghiệm

Dung dịch nội chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 5 mg chất chuẩn nội

Để chuẩn bị dung dịch Indomethacin (IDM), cho 10 ml IDM vào bình định mức, thêm khoảng 5 ml methanol (MeOH) và siêu âm trong 5 phút Sau đó, thêm MeOH đến vạch định mức và lắc đều Dung dịch thu được có nồng độ IDM khoảng 500 µg/ml, từ đó pha loãng đến nồng độ phù hợp cho khảo sát.

Để chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc, cần cân chính xác khoảng 10 mg chất chuẩn PPIs và cho vào bình định mức 10 ml Tiếp theo, thêm khoảng 5 ml MeOH và siêu âm trong 5 phút Sau đó, bổ sung MeOH đến vạch định mức và lắc đều Dung dịch thu được sẽ có nồng độ hỗn hợp OPZ, LPZ, PPZ và RPZ khoảng 1000 µg/ml.

2.2.1.2 Dung dịch chuẩn làm việc

Từ dung dịch chuẩn gốc, dung dịch được pha loãng với MeOH tạo ra hai dung dịch chuẩn làm việc (SW) Nồng độ hỗn hợp các PPIs trong dung dịch SW1 là 144 µg/ml, trong khi đó nồng độ trong dung dịch SW2 là 18 µg/ml.

Thực hiện tính toán lượng thể tích cần thiết của dung dịch SW1 và SW2 trong

400 l huyết tương để thu được các mẫu đối chiếu có nồng độ hỗn hợp các PPIs là

2000 ng/ml và IS là 8000 ng/ml sau khi xử lý mẫu

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc thứ hai và pha loãng đến nồng độ phù hợp Sau đó, thêm một lượng nhất định dung dịch này vào 400 μl huyết tương để tạo ra các mẫu với nồng độ thấp (LQC), nồng độ trung bình (MQC) và nồng độ cao (HQC), với nồng độ sau khi xử lý mẫu lần lượt là 1000 ng/ml, 3000 ng/ml và 5000 ng/ml.

Lấy 400 µl huyết tương trắng cho vào ống ly tâm, sau đó thêm 50 µl dung dịch SW hỗn hợp PPIs (hoặc QC) và vortex trong 30 giây Tiếp theo, thêm 50 µl dung dịch chất nội chuẩn và vortex trong 1 phút để thu được mẫu giả lập.

Qui trình nghiên cứu được thực hiện qua các giai đoạn như Hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 2.2.2.1 Xây dựng điều kiện sắc ký

Nghiên cứu xây dựng điều kiện sắc ký được thực hiện trên máy HPLC Agilent

Xây dựng điều kiện sắc ký

Phương pháp xử lý mẫu

Thẩm định quy trình phân tích đã chọn

Nghiên cứu này tập trung vào việc xử lý kết quả và viết báo cáo về các chất nghiên cứu bằng kỹ thuật sắc ký pha đảo Đề tài khảo sát các điều kiện sắc ký trên cột sắc ký C18 kích thước 150 x 4,6 mm với kích thước hạt 5 µm, sử dụng cột bảo vệ cùng loại.

Bước sóng phát hiện được xác định thông qua việc khảo sát các dung dịch chuẩn OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong MeOH với nồng độ khoảng 5 µg/ml Phân tích quang phổ hấp thu UV được thực hiện trên máy quang phổ UV 1800 (Shimadzu) cho bốn dung dịch này, từ đó chọn lựa bước sóng phát hiện phù hợp.

Pha động: Thăm dò một số pha động, sử dụng hỗn hợp pha động là MeOH,

ACN được sử dụng kết hợp với dung dịch có pH thay đổi, như dung dịch đệm hoặc dung dịch kiềm, ở các tỷ lệ phù hợp nhằm đảm bảo sự tách biệt và độ cân đối của pic đạt tiêu chuẩn.

Tốc độ dòng, nhiệt độ cột và thể tích tiêm mẫu được khảo sát đồng thời để đảm bảo các pic PPIs và IDM tách biệt hoàn toàn, đồng thời phân tách khỏi các pic tạp Điều này giúp đạt được độ tinh khiết cần thiết cho định lượng và các thông số sắc ký đạt yêu cầu.

 Hệ số phân giải giữa các chất không nhỏ hơn 1,5

 Số đĩa lý thuyết của các pic không nhỏ hơn 3000

 Hệ số bất đối xứng của các pic từ 0,9 đến 1,5

 Thời gian phân tích cho một mẫu khoảng 20 phút

 RSD % của thời gian lưu của các pic với 6 lần tiêm lặp lại không lớn hơn 2,0

 RSD% của tỷ lệ diện tích pic chất chuẩn/nội chuẩn của 6 lần tiêm lặp lại ở nồng độ định lượng không lớn hơn 2,0 %

2.2.2.2 Phương pháp xử lý mẫu

Tiến hành khảo sát các phương pháp chiết tách sau đây:

Phương pháp gây tủa protein bằng dung môi hữu cơ bao gồm việc thêm 50 µl dung dịch KOH 0,25 M và 1,2 ml dung dịch MeOH hoặc ACN vào mẫu thử giả lập Sau khi vortex trong 5 phút, tiến hành ly tâm ở tốc độ 12000 vòng/phút trong 10 phút Lấy dịch nổi và lọc qua màng PTFE 0,22 µm để thu được dịch lọc cho việc tiêm sắc ký Đồng thời, thực hiện quy trình này song song với mẫu được chiết không kiềm hóa.

Phương pháp chiết phân bố lỏng – lỏng được thực hiện từ mẫu thử giả lập bằng cách thêm 4,5 ml hỗn hợp dung môi diethyl ether và triethylamin với tỷ lệ 99:1, sau đó vortex trong 5 phút Tiếp theo, mẫu được ly tâm ở 4500 vòng/phút trong 10 phút Lấy 3 ml dịch nổi và bốc hơi ở 40 °C bằng máy ủ nhiệt khô Cuối cùng, cắn thu được được hòa tan vào 1 ml dung dịch pha động và lọc qua màng PTFE 0,45 µm để chuẩn bị cho quá trình tiêm sắc ký.

2.2.2.3 Thẩm định quy trình phân tích đã chọn

Quy trình phân tích được thực hiện theo hướng dẫn của FDA, đảm bảo các tiêu chí như tính đặc hiệu, đường chuẩn, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ đúng, độ chính xác, hiệu suất chiết và độ ổn định mẫu Trong đó, việc kiểm tra tính tương thích hệ thống là một bước quan trọng.

Tiến hành tiêm 6 lần liên tiếp mẫu đối chiếu với cùng nồng độ và điều kiện, yêu cầu RSD % cho thời gian lưu hoặc thời gian di chuyển phải ≤ 2 %, và tỷ số diện tích pic (RS/IS) của chất cần định lượng cũng phải ≤ 2 % Hệ số T phải nằm trong khoảng 0,8 ≤ T ≤ 1,5, đồng thời độ phân giải giữa các pic cần định lượng cần đạt Rs ≥ 1,5.

Tiến hành sắc ký mẫu pha động và mẫu đối chiếu, bao gồm mẫu huyết tương trắng, mẫu huyết tương chứa thử, và mẫu huyết tương có thêm chất đối chiếu Tất cả mẫu được xử lý theo quy trình tối ưu đã được xác định từ khảo sát các phương pháp xử lý mẫu Ghi lại sắc ký đồ và đánh giá độ tinh khiết của tín hiệu sắc ký bằng đầu dò dãy diod quang.

Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn các điều kiện sau [26]:

Sắc ký đồ của mẫu trắng và mẫu pha động không hiển thị các tín hiệu tại thời gian lưu của các pic cần định lượng trong sắc ký đồ của mẫu đối chiếu.

 Sắc ký đồ của mẫu thử có các pic có thời gian lưu tương ứng với sắc ký đồ hoặc điện di đồ của mẫu đối chiếu

PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ KẾT QUẢ

Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê kết hợp với Microsoft Office Excel 16 giúp phân tích các đại lượng đặc trưng hiệu quả Một số công thức tính toán quan trọng được áp dụng trong việc xử lý và phân tích kết quả thống kê.

𝑛 − 1 tương ứng với hàm STDEV.S trong Microsoft Excel

 Độ lệch chuẩn tương đối (RSD %):

Phương trình hồi quy tuyến tính bậc nhất, y = ax + b, mô tả mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích Để xác minh độ phù hợp của phương trình này, cần thực hiện phân tích trắc nghiệm Fischer Đồng thời, phân tích trắc nghiệm Student sẽ được sử dụng để đánh giá ý nghĩa thống kê của các hệ số a và b.

 Các kết quả khác nhau có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

XÂY DỰNG ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ

Dựa trên tính chất hóa lý của các PPIs và tham khảo tài liệu, chúng tôi đã chọn kỹ thuật sắc ký pha đảo với đầu dò dãy diod quang để khảo sát Điều kiện sắc ký ban đầu bao gồm cột sắc ký XDB Zobrax C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm) và cột bảo vệ C18 (4 x 4,6 mm, 5 µm) từ Agilent (Mỹ) Thể tích tiêm mẫu là 20 µl, tốc độ dòng 1,0 ml/phút và bước súng ghi nhận tín hiệu từ.

Trong khoảng sóng 190 – 400 nm, chúng tôi đã tiến hành thăm dò các hỗn hợp dung môi ACN/MeOH và nước ở các pH và tỷ lệ khác nhau Mục tiêu là chọn điều kiện sắc ký để các pic PPI tách biệt rõ ràng với nhau và với các pic tạp chất Kết quả cho thấy tín hiệu pic sắc ký đạt độ cân đối, tinh khiết và có thời gian phân tích phù hợp.

3.1.1 Kết quả khảo sát bước sóng phát hiện

Quá trình quét phổ hấp thu được thực hiện trên máy UV 1800 (Shimadzu) trong khoảng bước sóng từ 190 - 400 nm đối với các dung dịch OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong MeOH với nồng độ khoảng 5 µg/ml cho mỗi chất Kết quả thu được cho thấy OPZ có cực đại ở 301 nm, LPZ và RPZ đều có cực đại ở 283,5 nm, trong khi PPZ có cực đại ở 289 nm Bước sóng 285 nm đã được chọn để ghi nhận tín hiệu cho cả bốn PPIs trong các nghiên cứu tiếp theo.

Spectrum_Omeprazol_20180513_110258 - Raw Data nm.

Spectrum_Lansoprazol_20180513_104314 - Raw Data nm.

Hình 3.1 Phổ UV của OPZ, LPZ, PPZ, PPZ 3.1.2 Kết quả khảo sát pha động

Dựa trên tài liệu tham khảo [10], [12], [18], [19], [24], nghiên cứu lựa chọn tốc độ dòng cố định là 1,0 ml/phút, bước sóng 285 nm và thể tích tiêm 10 µl cho mẫu chuẩn pha trong MeOH Nghiên cứu tiến hành khảo sát thăm dò một số pha động, sử dụng hỗn hợp MeOH, ACN và nước với các tỷ lệ khác nhau.

 ACN/MeOH và dung dịch đệm phosphat 5 mM pH 8 (KH2PO4 được điều chỉnh bằng dung dịch KOH)

 ACN/MeOH và dung dịch đệm nati acetat 5 mM pH 7,6 (được điều chỉnh bằng dung dịch TEA 1%)

 ACN/MeOH và nước 0,3% TEA, pH 7,2 (được điều chỉnh bằng dung dịch acid acetic)

3.1.2.1 Khảo sát hệ pha động 1

Sử dụng pha động gồm hỗn hợp MeOH và KH2PO4 5 mM (điều chỉnh pH đến 8,0 bằng KOH 1 M) với tỷ lệ 40:60 (tt/tt), sắc ký đồ thu được như Hình 3.2 cho thấy các pic PPIs có sự tách biệt nhưng vẫn còn nhiều sự chồng chéo và pic bị giãn, không đạt độ tinh khiết cao.

Spectrum_Rabeprazol_20180513_105240 - Raw Data nm.

Spectrum_Pantoprazol_20180513_103351 - Raw Data nm.

Hình 3.2 SKĐ khảo sát pha động MeOH – đệm phosphat 5 mM, pH 8 (40 : 60) 3.1.2.2 Khảo sát hệ pha động 2

Dựa trên khảo sát hệ pha động 1, các tỷ lệ pha động của hỗn hợp MeOH và KH2PO4 5 mM đã được điều chỉnh pH đến 8,0 bằng KOH 1M với tỷ lệ 75:25 (tt/tt), từ đó thu được sắc ký đồ như thể hiện trong Hình 3.3.

Hình 3.3 cho thấy sự tách biệt gần như hoàn toàn của các tín hiệu PPIs trong khảo sát pha động MeOH – đệm phosphat 5 mM, pH 8 (75 : 25) Tuy nhiên, với thông số độ phân giải Rs < 1,5, phương pháp này chưa đạt yêu cầu cho việc định lượng chính xác.

3.1.2.3 Khảo sát hệ pha động 3

Sử dụng pha động là hỗn hợp ACN và dung dịch KH2PO4 5 mM, được điều chỉnh pH đến 8,0 bằng KOH 1M với tỷ lệ 40:60, sắc ký đồ thu được như trong Hình 3.4.

DAD1 A, Sig(5,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\KHAO_SAT000020.D)

DAD1 A, Sig(0,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\SAMPLE_1000109.D)

3 6 56 8 3 36 thấy, trên sắc ký đồ Hình 3.4 đường nền ổn định, nhưng các pic PPIs không tách nhau

Hình 3.4 SKĐ khảo sát pha động ACN – đệm phosphat 5 mM, pH 8 (40 : 60) 3.1.2.4 Khảo sát hệ pha động 4

Dựa trên khảo sát hệ pha động 3, tỷ lệ thành phần dung môi ACN được điều chỉnh thành 25% và đệm phosphat KH2PO4 5 mM (pH 8,0 điều chỉnh bằng KOH 1M) được sử dụng với tỷ lệ 75% Sắc ký đồ thu được được trình bày trong Hình 3.5.

Hình 3.5 thể hiện kết quả khảo sát pha động ACN với đệm phosphat 5 mM, pH 8 (tỷ lệ 25:75) Kết quả cho thấy việc thay thế MeOH bằng ACN trong hệ pha động 2 đã cải thiện khả năng tách, với các thông số sắc ký đạt yêu cầu cho phương pháp định lượng Cụ thể, pic có độ cân đối (T ≈ 1), độ phân giải Rs > 2 và số đĩa lý thuyết N > 3000 cho mỗi chất Thời gian phân tích cho 4 chất là một yếu tố quan trọng trong quy trình này.

30 DAD1 A, Sig(0,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\PPI000016.D)

Hệ pha động 4 được lựa chọn làm cơ sở cho các khảo sát tiếp theo do tính phù hợp tương đối của nó (6.657) trong thời gian ngắn (< 15 phút) và tiêu tốn ít dung môi.

Hỗn hợp pha động ACN và đệm natri acetat 5 mM (điều chỉnh pH đến 7,6 bằng TEA 1 %), với tỷ lệ 25 : 75 (tt/tt) thu được sắc ký đồ ở Hình 3.6

Hình 3.6 trình bày hệ pha động ACN với đệm natri acetat 5 mM, pH 7,6 (tỷ lệ 25:75) cho thấy khả năng phân tách tương đương với hệ số 4 Các thông số sắc ký như hệ số T (0,8 – 1,5), độ phân giải Rs > 2, số đĩa lý thuyết N > 3000, và hệ số phân bố k’ (< 5) đều đáp ứng tiêu chuẩn cần thiết cho một phép định lượng hiệu quả.

Hỗn hợp pha động gồm ACN và nước kiềm 0,3% TEA (điều chỉnh pH 7,2 bằng acid acetic) với tỷ lệ 55:45 (tt/tt) đã được sử dụng để thu được sắc ký đồ như thể hiện trong Hình 3.7 Trên sắc ký đồ này, các pic tách nhau chưa hoàn toàn.

Hình 3.7 SKĐ khảo sát pha động ACN – nước 0,3 % TEA, pH 7,2 (55 : 45) 3.1.2.7 Khảo sát pha động 7

Hỗn hợp pha động được sử dụng trong sắc ký bao gồm MeOH, ACN và nước kiềm 0,3% TEA, đã được điều chỉnh pH đến 7,2 bằng acid acetic, với tỷ lệ 32:15:53 (tt/tt/tt) Sắc ký đồ thu được được trình bày trong Hình 3.8.

Hình 3.8 SKĐ khảo sát pha động MeOH – ACN – nước 0,3 % TEA, pH 7,2 (32 : 15 : 53)

Trên sắc ký đồ Hình 3.8, các pic của các PPIs được tách biệt hoàn toàn với tín hiệu sắc nét và cân đối Các thông số sắc ký cho thấy hệ số T nằm trong khoảng 0,8 – 1,5, số đĩa lý thuyết N lớn hơn 3000, độ phân giải Rs vượt quá 2, hệ số phân bố k’ nhỏ hơn 5, và thời gian phân tích cho một quy trình không quá 15 phút Ngoài ra, việc lựa chọn pha động mang lại nhiều ưu điểm.

DAD1 A, Sig(5,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\PANTOPRAZOLE002.D)

PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU

Tiến hành khảo sát các phương pháp xử lý mẫu huyết tương khác nhau, đánh giá và lựa chọn phương pháp phù hợp để thực hiện xử lý mẫu

Để xử lý mẫu huyết tương bằng cách gây tủa protein, đầu tiên thêm 400 µl huyết tương trắng, 50 µl dung dịch chuẩn hỗn hợp các PPIs với nồng độ khoảng 18 µg/ml và 50 µl dung dịch chuẩn IS, sau đó lắc xoáy trong 30 giây Tiếp theo, thêm 1,2 ml MeOH và lắc xoáy trong 2 phút, rồi ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 15 phút Lấy dịch nổi và lọc qua màng lọc có kích thước lỗ 0,22 µm, tiêm 10 µl vào hệ thống phân tích sắc ký, thu được SKĐ Hình 3.10b Quy trình này cũng được thực hiện với việc thêm 100 µl dung dịch KOH 0,25M, cho kết quả SKĐ Hình 3.10c.

Xử lý mẫu huyết tương bằng phương pháp chiết phân bố lỏng - lỏng bao gồm các bước như sau: Đầu tiên, trộn 400 µl huyết tương trắng với 50 µl dung dịch chuẩn hỗn hợp các PPIs có nồng độ khoảng 18 µg/ml và 50 µl dung dịch chuẩn IS, sau đó lắc xoáy trong 30 giây Tiếp theo, thêm 4,5 ml hỗn hợp dung môi diethyl ether - triethylamin (99:1) và lắc xoáy trong 5 phút Sau đó, ly tâm ở 4500 vòng/phút trong 10 phút, lấy 3 ml dịch nổi và bốc hơi ở 40 °C bằng máy ủ nhiệt khô Cuối cùng, hòa tan cặn thu được vào 1 ml dung dịch pha động, lọc qua màng PTFE kích thước lỗ 0,45 µm và tiêm 10 µl vào hệ thống phân tích sắc ký Đồng thời, tiến hành mẫu có chứa hỗn hợp các chất chuẩn PPIs và IS với nồng độ tương ứng trong pha động, cũng được lọc qua màng lọc PTFE kích thước lỗ 0,45 µm để tạo dịch tiêm sắc ký.

DAD1 A, Sig(5,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\PPI_08092018_09-09 15-55-52\072-0101.D)

DAD1 A, Sig(5,4 Ref=off (D:\MET HO D\DS.HÀ\KHAO _SAT 000089.D)

DAD1 A, Sig(5,4 Ref=off (D:\MET HO D\DS.HÀ\DEF_LC 2018-09-08 08-39-09\023-2301.D)

Hình 3.10 minh họa các mẫu huyết tương khác nhau: a huyết tương trắng; b huyết tương xử lý bằng phương pháp gây tủa protein với MeOH; c huyết tương xử lý bằng phương pháp gây tủa protein với MeOH kết hợp với dung dịch kiềm hóa KOH; d huyết tương xử lý bằng phương pháp chiết phân bố lỏng - lỏng; và e mẫu chuẩn cùng mẫu nội chuẩn pha trong pha động (hệ pha động số 7).

Nhận xét: Hình 3.10a, mẫu huyết tương trắng hoàn toàn không xuất hiện pic

Sắc ký đồ trong Hình 3.10b cho thấy các pic chưa được tách biệt và vẫn còn xen lẫn với nền mẫu, dẫn đến việc pic bị giãn và chồng chéo lên nhau Điều này cho thấy điều kiện hiện tại chưa phù hợp để xử lý mẫu Ngược lại, sắc ký đồ trong Hình 3.10c và Hình 3.10d cho thấy các pic IS và PPIs đã được tách biệt rõ ràng hơn.

DAD1 A, Sig(5,4 Ref=off (D:\MET HO D\DS.HÀ\DEF_LC 2018-09-12 14-39-56\SAMPLE000001.D)

Phương pháp gây tủa protein có kiềm hóa và chiết tách phân bố lỏng – lỏng là những lựa chọn hiệu quả để xử lý mẫu 5.7 0 5 - IN D O M E T H A C, với hình ảnh cân đối tương tự như SKĐ mẫu chuẩn trong pha động.

Kết quả phân tích ANOVA cho thấy hai phương pháp chiết có tỷ lệ phục hồi cao trên 80%, RSD dưới 15% và p lớn hơn 0,05, chứng tỏ không có sự khác biệt thống kê giữa chúng Phương pháp gây tủa protein với kiềm hóa có ưu điểm là nhanh chóng và dễ thực hiện, đồng thời đáp ứng yêu cầu phân tích mẫu trong dịch sinh học Do đó, phương pháp này được chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.

Bảng 3.1 Kết quả phân tích ANOVA các phương pháp xử lý mẫu

Value TB ± SD % sai khac P -Value

Ghi chú: MQC 3000 ng/ml Phương pháp 1: gây tủa protein có kiềm hóa mẫu Phương pháp 2: chiết tách phân bố lỏng – lỏng

THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐÃ CHỌN

3.3.1 Tính tương thích hệ thống

Việc thẩm định tính tương thích của hệ thống là rất quan trọng trong các phương pháp phân tích bằng sắc ký, nhằm xác định độ phân giải và độ lặp lại của hệ thống phân tích Trong nghiên cứu này, khi thực hiện tiêm lặp lại 6 lần dung dịch mẫu huyết tương giả lập với nồng độ các PPIs khoảng 1000 ng/ml và IS khoảng 8000 ng/ml, kết quả thu được đã được trình bày trong Bảng 3.2.

Kết quả phân tích từ Bảng 3.2 cho thấy các thông số sắc ký như thời gian lưu (tR), hệ số phân bố (k’), và tỷ lệ diện tích pic của chất chuẩn/chất nội chuẩn (RS/IS) đều có RSD < 2% Số đĩa lý thuyết (N) vượt quá 3000, hệ số bất đối (T) nằm trong khoảng 0,8 – 1,5, và độ phân giải (Rs) lớn hơn 1,5 Điều này chứng tỏ rằng phương pháp đã xây dựng đạt tính tương thích hệ thống cao.

Bảng 3.2 Bảng kết quả phân tích tính tương thích hệ thống

STT t R k' R S/IS T N Rs t R k' R S/IS T N Rs t R k' R S/IS T N Rs t R k' R S/IS T N Rs

Ghi chú: t R (thời gian lưu); k’(hệ số phân bố); R S/IS (tỷ lệ diện tích chất chuẩn/chất nội chuẩn); T (USB Tailling); N (Số đĩa lý thuyết); Rs (Độ phân giải)

3.3.2 Thẩm định tính đặc hiệu

Phân tích các mẫu pha động, bao gồm mẫu chuẩn và nội chuẩn, được thực hiện với huyết tương trắng, huyết tương chứa mẫu thử, và huyết tương chứa mẫu thử thêm chuẩn (giả lập) có nồng độ 2000 ng/ml với chất nội chuẩn indomethacin theo phương pháp đã xây dựng Kết quả sắc ký đồ của các mẫu được trình bày chi tiết trong Hình 3.11.

DAD1 A, Sig(5,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\PPI_08092018_09-09 15-55-52\072-0101.D)

Hình 3.11 SKĐ: a mẫu huyết tương trắng; b mẫu thử giả lập; c mẫu huyết tương chứa mẫu thử thêm chuẩn; d mẫu pha động

Nhận xét: Trên sắc ký đồ các pic tách rời nhau, tại thời gian lưu 5,7; 7,0; 8,4;

Phân tích tín hiệu của IDM, PPZ, OMZ, RPZ và LPZ cho thấy thời gian lưu tương ứng là 9,5 và 13,3 phút (Hình 3.11b, c) Tuy nhiên, trên sắc ký đồ của mẫu pha động và mẫu huyết tương trắng không ghi nhận pic của các chất này (Hình 3.11a, d) Phổ hấp thu UV cho mỗi tín hiệu được ghi nhận (Hình 3.12a, b, c, d, e) và độ tinh khiết pic của mẫu thử đạt trên 99,99% theo phần mềm Chemstation - Agilent (Hình 3.12f, g, h, i, j) Phương pháp phân tích đã chứng minh khả năng nhận diện và phân biệt các PPIs và IS mà không bị ảnh hưởng bởi tạp chất trong huyết tương, cho thấy tính chọn lọc và độ đặc hiệu cao của phương pháp.

9 DAD1 A, Sig(5,4 Ref=off (D:\MET HO D\DS.HÀ\DEF_LC 2018-09-08 08-39-09\023-2301.D)

-0.75 -0.5 -0.25 0 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5 DAD1 A, Sig(5,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\khao sat\Mau pha dong.D)

Hình 3.12 Phổ hấp thu UV: a IS; b PPZ; c OPZ; d RPZ ; e LPZ; Độ tinh khiết

3.3.3 Thẩm định độ tuyến tính

Chuẩn bị các mẫu huyết tương theo hướng dẫn tại mục 2.2.1 và xử lý chúng theo quy trình đã chỉ định trong mục 3.2 Tiến hành phân tích sắc ký để khảo sát mối tương quan tuyến tính giữa tỷ lệ nồng độ và tỷ lệ diện tích pic của chất chuẩn và chất nội chuẩn trong mẫu huyết tương.

Bảng 3.3 Kết quả thẩm định độ tuyến tính của PPZ

Diện tích pic PPZ (mAU.s) 24,668 30,765 67 120,85 254,07 Diện tích pic IS (mAU.s) 310,79 315,45 308,48 309,68 313,46

Tỷ lệ diện tích pic 0,07937 0,09753 0,21719 0,39024 0,81053 Phương trình hồi quy (y = a.x +b) y = 0,7957.x ; r 2 = 0,999 y là tỷ lệ diện tích S/IS; x là tỷ lệ nồng độ S/IS

Hình 3.13 Đường biểu diễn tương quan giữa tỷ lệ diện tích S/IS và tỷ lệ nồng độ của PPZ

Kết quả từ trắc nghiệm Fischer cho thấy phương trình phù hợp với hệ số F = 1198,07, lớn hơn F0,05 = 7,77 Trong khi đó, trắc nghiệm Student chỉ ra rằng hệ số a (Slope) có ý nghĩa thống kê với t = 34,61, vượt quá t0,05 = 2,77 và p < 0,05 Ngược lại, hệ số b (Intercept) không có ý nghĩa thống kê với t = 1,09, thấp hơn t0,05 = 2,77 và p > 0,05.

Bảng 3.4 Kết quả thẩm định độ tuyến tính của OPZ

Diện tích pic OPZ (mAU.s) 23,765 42,695 94,813 164,26 353,66 Diện tích pic IS (mAU.s) 310,79 315,45 308,48 309,68 313,46

Hình 3.14 Đường biểu diễn tương quan giữa tỷ lệ diện tích S/IS và tỷ lệ nồng độ của OPZ

Qua trắc nghiệm Fischer, phương trình cho thấy hệ số F = 1254,56, vượt qua ngưỡng F0,05 = 7,77, cho thấy tính tương thích của mô hình Đồng thời, trắc nghiệm Student chỉ ra rằng hệ số a (Slope) có ý nghĩa thống kê với t = 35,41978, lớn hơn t0,05 = 2,77 và p < 0,05 Ngược lại, hệ số b (Intercept) không có ý nghĩa thống kê, với t = 0,216169 nhỏ hơn t0,05 = 2,77 và p > 0,05.

Bảng 3.5 Kết quả thẩm định độ tuyến tính của RPZ

Diện tích pic RPZ (mAU.s) 21,98 34,79 75,67 133,27 274,27 Diện tích pic IS (mAU.s) 310,79 315,45 308,48 309,68 313,46

Hình 3.15 Đường biểu diễn tương quan giữa tỷ lệ diện tích S/IS và tỷ lệ nồng độ của RPZ

Kết quả từ trắc nghiệm Fischer cho thấy phương trình có hệ số F = 2210,779, lớn hơn F0,05 = 7,77, chứng tỏ tính tương thích cao Đồng thời, trắc nghiệm Student cho thấy hệ số a (Slope) có ý nghĩa thống kê với t = 47,0189, vượt qua t0,05 = 2,77 (p < 0,05), trong khi hệ số b (Intercept) không có ý nghĩa thống kê với t = 1,47356, nhỏ hơn t0,05 = 2,77 (p > 0,05).

Bảng 3.6 Kết quả thẩm định độ tuyến tính của LPZ

Diện tích pic LPZ (mAU.s) 21,15 36,09 80,61 159,91 310,46 Diện tích pic IS (mAU.s) 310,79 315,45 308,48 309,68 313,46

Hình 3.16 Đường biểu diễn tương quan giữa tỷ lệ diện tích S/IS và tỷ lệ nồng độ của LPZ

Qua trắc nghiệm Fischer, phương trình cho thấy sự tương thích với hệ số F = 3063,9404, lớn hơn F0,05 = 7,77 Đồng thời, trắc nghiệm Student chỉ ra rằng hệ số a (Slope) có ý nghĩa thống kê với t = 55,3528, vượt qua t0,05 = 2,77 và p < 0,05 Ngược lại, hệ số b (Intercept) không có ý nghĩa thống kê khi t = 0,61423, nhỏ hơn t0,05 = 2,77 và p > 0,05.

3.3.4 Giới hạn định lượng dưới

Dựa vào kết quả thẩm định tính tuyến tính, xác định nồng độ thấp nhất (độ nhạy) mà phương pháp vẫn đảm bảo tính đúng và chính xác, dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng với độ dốc đường tuyến tính.

LLOQ của PPZ, OPZ, RPZ và LPZ được xác định lần lượt là 480,0698 ng/ml; 507,2739 ng/ml; 484,8794 ng/ml và 505,3141 ng/ml

3.3.5 Thẩm định độ đúng, độ lặp lại

Tiến hành thẩm định độ đúng, độ lặp lại trên 3 lô mẫu LQC 1000 ng/ml, MQC

Nồng độ 3000 ng/ml và HQC 5000 ng/ml được xử lý theo quy trình đã được xây dựng Kết quả thẩm định độ đúng và độ lặp của phương pháp được trình bày chi tiết trong Bảng 3.7 và Bảng 3.8.

Bảng 3.7 Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày (3 ngày)

LQC (1000 ng/ml) MQC (3000 ng/ml) HQC (5000 ng/ml) Nồng độ

(ng/ml) Độ đúng (%) Nồng độ

(ng/ml) Độ đúng (%) PPZ

Nhận xét: Kết quả từ Bảng 3.7, Bảng 3.8 và kết quả phân tích thống kê Bảng

3.9 cho thấy tất cả các lô mẫu phân tích ở 3 nồng độ thấp, trung bình và cao có độ đúng trong ngày và giữa các ngày nằm trong giới hạn cho phép (85 – 115 %) Độ lặp lại (độ chính xác) trong ngày và giữa các ngày đều đạt yêu cầu RSD < 15 % với giá trị cao nhất là 10,87 % Do đó, phương pháp có độ đúng, độ chính xác cao, đáp ứng được yêu cầu của phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học

Bảng 3.8 Kết quả thẩm định độ chính xác (độ lặp lại) trong ngày và khác ngày

Nồng độ tìm thấy (LQC

Nồng độ tìm thấy (MQC

Nồng độ tìm thấy (HQC

Bảng 3.9 Số liệu của Summary Statistics (Độ đúng)

Standard Deviation 7,3754 5,5337 5,0450 7,6938 5,7434 5,7906 9,5362 7,0570 5,3894 7,9744 5,9140 4,4294 Sample Variance 54,3967 30,6215 25,4516 59,1944 32,9861 33,5306 90,9394 49,8018 29,0459 63,5903 34,9755 19,6194 Kurtosis 1,10536 -0,62160 1,88544 -0,57795 2,70443 0,73201 0,64044 -0,76552 -0,82529 -0,79734 0,02974 -0,59023 Skewness -0,86578 -0,20133 0,63237 0,18300 -1,35487 0,49241 -0,43191 -0,03878 -0,18885 -0,35983 -0,47486 -0,12846

Bảng 3.10 Kết quả hiệu suất chiết của PPZ và OPZ

Mẫu LQC/MP % tìm lại

Mẫu HQC/MP % tìm lại

R (S/IS) /HT R (S/IS) /MP R (S/IS) /HT R (S/IS) /MP R (S/IS) /HT R (S/IS) /MP R (S/IS) /HT R (S/IS) /MP

Ghi chú: R (S/IS) tỷ lệ diện tích pic chất chuẩn/chất nội chuẩn, LQC (1000 ng/ml), HQC (5000 ng/ml)

Bảng 3.11 Kết quả hiệu suất chiết của RPZ và LPZ

R (S/IS) /HT R (S/IS) /MP R (S/IS) /HT R (S/IS) /MP R (S/IS) /HT R (S/IS) /MP R (S/IS) /HT R (S/IS) /MP

Ghi chú: R (S/IS) tỷ lệ diện tích pic chất chuẩn/chất nội chuẩn, LQC (1000 ng/ml), HQC (5000 ng/ml)

Để phân tích các lô mẫu LQC 1000 ng/ml và HQC 5000 ng/ml trong huyết tương, chúng tôi đã tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã được thiết lập Song song với đó, các mẫu có nồng độ tương ứng trong pha động cũng được thực hiện Kết quả so sánh tỷ lệ S/IS của các mẫu được trình bày chi tiết trong Bảng 3.10 và Bảng 3.11.

Kết quả khảo sát cho thấy hiệu suất chiết trung bình của các lô mẫu LQC 1000 ng/ml và HQC 5000 ng/ml lần lượt là 83,11 % và 89,36 % cho PPZ; 86,21 % và 92,34 % cho OPZ; 89,48 % và 97,15 % cho RPZ; 91,48 % và 97,15 % cho LPZ RSD của tất cả các lô mẫu không vượt quá 15 %, với giá trị dao động từ 4,77 % đến 13,02 % Do đó, quy trình xử lý mẫu đáp ứng yêu cầu theo quy định của phương pháp phân mẫu trong dịch sinh học.

3.3.7.1 Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc

Tiến hành phân tích và so sánh tỷ lệ S/IS của dung dịch chuẩn gốc trong MeOH sau khi bảo quản ở 2 – 8 oC trong 1, 3 và 5 ngày với dung dịch gốc vừa pha (thời điểm ban đầu) Kết quả cho thấy sau 5 ngày bảo quản, dung dịch chỉ sai khác không quá 2% so với thời điểm ban đầu, với mức lớn nhất là 1,67% Độ lệch chuẩn tương đối của các lô mẫu phân tích đều nhỏ hơn 2%, cho thấy dung dịch gốc ổn định trong thời gian 5 ngày ở điều kiện này.

Bảng 3.12 Kết quả thẩm định độ ổn định dung dịch chuẩn gốc PPIs và IS

3.3.7.2 Độ ổn định của hoạt chất trong huyết tương

BÀN LUẬN

Phương pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học là yếu tố then chốt để đánh giá chính xác các số liệu dược động học, cũng như phân tích dữ liệu trong nghiên cứu sinh khả dụng (SKD) và tính sinh khả dụng (TĐSH) Việc đánh giá và thẩm định các phương pháp này là cần thiết để đảm bảo rằng kết quả phân tích đạt được là chính xác, ổn định và đáng tin cậy.

Trong việc định lượng các PPIs, nhiều phương pháp như quang phổ hấp thu phân tử (UV - VIS), cực phổ và sắc ký lỏng hiệu năng cao được áp dụng Tuy nhiên, với mẫu phức tạp như dịch sinh học và nồng độ thấp, sắc ký lỏng trở thành tiêu chuẩn vàng cho việc xác định OPZ, LPZ, PPZ và RPZ Sau khi qua hệ thống sắc ký, mẫu có thể được phân tích bằng đầu dò khối phổ, quang phổ tử ngoại hoặc đầu dò dãy diod quang Mặc dù đầu dò khối phổ có độ nhạy cao, nhưng chưa phổ biến trong nước do chi phí đầu tư lớn và yêu cầu nhiều điều kiện kèm theo Trong nghiên cứu này, đầu dò DAD được sử dụng cho hệ thống HPLC, một giải pháp phổ biến trong hầu hết các phòng thí nghiệm hiện nay.

Phương pháp đã được xây dựng và thẩm định thành công với các tiêu chí như tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng và độ lặp lại, giới hạn định lượng, tỷ lệ thu hồi (hiệu suất chiết), cùng với độ ổn định của mẫu thử, đáp ứng đầy đủ yêu cầu của FDA.

Trong phương pháp phân tích dịch sinh học, chuẩn nội đóng vai trò quan trọng nhằm hạn chế sai số Chuẩn nội có tính chất lý hóa tương tự với chất phân tích và được thêm vào cùng lúc để đảm bảo độ chính xác Các PPIs và IDM có đặc điểm lý hóa gần giống nhau, cho phép sử dụng IDM làm chuẩn nội để định lượng các PPIs IDM là một chất chuẩn dễ kiếm, với cực đại hấp thụ gần với các PPIs So với nghiên cứu của Noubarani và cộng sự, phương pháp này cho phép định lượng cả bốn PPIs trên cùng một sắc ký đồ và trong một lần phân tích.

Việc áp dụng IDM giúp tiết kiệm thời gian, hóa chất và chi phí trong quá trình thực nghiệm Điều này khiến IDM trở thành một chuẩn nội đồng phổ biến, dễ dàng tìm kiếm và đáp ứng các yêu cầu cần thiết.

Để xác định điều kiện sắc ký tối ưu cho các PPIs, cần khảo sát các pha động với tỷ lệ khác nhau dựa trên các thông số của pic sắc ký và độ ổn định của chất phân tích Do tính kém bền của PPIs, đặc biệt trong môi trường pH thấp, việc chọn pH phù hợp cho pha động là rất quan trọng nhằm giảm thiểu sự phân hủy của chúng, đồng thời đảm bảo các thông số sắc ký đạt yêu cầu Nghiên cứu trước đây cho thấy việc sử dụng pH 4,5 cho đệm là không hợp lý.

[12], nhưng chủ yếu các tác giả sử dụng pH của đệm là khoảng 7,0 [10], [16],

Nghiên cứu ban đầu cho thấy, việc sử dụng các hệ dung môi có đệm như đệm phosphat và đệm acetat với pH điều chỉnh đến 8,0 giúp phân tách tốt các PPIs, tạo ra các pic sắc ký rõ ràng Tuy nhiên, nhược điểm của dung dịch đệm là thời gian rửa cột kéo dài từ 2 - 3 giờ, không đáp ứng được yêu cầu phân tích nhanh và có thể gây ăn mòn hệ thống sắc ký khi sử dụng lâu dài Do đó, chúng tôi đã khảo sát các hệ pha động sử dụng dung dịch nước kiềm với pH điều chỉnh đến 7,2 Kết quả cho thấy, nước kiềm là dung dịch đơn giản, dễ pha, đảm bảo ổn định cho các PPIs trong quá trình phân tích, đồng thời các thông số sắc ký như số đĩa lý thuyết, hệ số phân giải và hệ số bất đối xứng đều đạt yêu cầu Đặc biệt, thời gian rửa cột được rút ngắn xuống còn khoảng 1 giờ, đáp ứng tốt nhu cầu xây dựng quy trình phân tích nhanh chóng và tiện lợi.

Với điều kiện sắc ký lựa chọn, phương pháp đảm bảo sự tách và ghi nhận các tín hiệu sắc ký rõ nét Độ đặc hiệu của phương pháp đã được chứng minh có khả năng phát hiện đồng thời các PPIs trên mẫu huyết tương phức tạp, thông qua việc so sánh các pic cần định lượng trên sắc ký đồ của mẫu đối chiếu và mẫu thử với mẫu trắng.

Khoảng tuyến tính được xây dựng với 5 điểm, bao gồm giới hạn định lượng dưới (LLOQ), cho thấy khoảng nồng độ tuyến tính nằm trong khoảng từ 500 đến một giá trị cụ thể.

Phương pháp phân tích nồng độ mẫu thử ở mức 8000 ng/ml cho phép xác định nồng độ các PPIs trong thời gian 3 – 5 lần thời gian bán thải hoặc 1/10 – 1/20 giá trị Cmax, phù hợp với khuyến cáo của FDA Hệ số tương quan hồi quy giữa đáp ứng phân tích và nồng độ PPIs trong huyết tương đạt r² > 0,999 Trắc nghiệm Fischer xác nhận tính tương thích của các phương trình trong nhóm PPIs, trong khi trắc nghiệm Student đánh giá ý nghĩa thống kê của hệ số gốc và tung độ gốc trong các phương trình xây dựng (y = a.x + b).

Phương pháp xác định nồng độ các PPIs trong huyết tương được kiểm tra độ đúng và độ lặp lại bằng cách thêm chuẩn vào các mẫu huyết tương trắng, với ba lô mẫu có nồng độ 1000 ng/ml, 3000 ng/ml và 5000 ng/ml, mỗi nồng độ có 6 mẫu Kết quả cho thấy độ đúng trong ngày và giữa các ngày đều nằm trong giới hạn cho phép (85 – 115 %), và độ lặp lại đạt yêu cầu với RSD < 15 % (giá trị cao nhất là 10,87 %) Do đó, phương pháp này có khả năng xác định chính xác và đáng tin cậy nồng độ các PPIs trong huyết tương.

Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) cho bốn chất trong nhóm thuốc ức chế bơm proton (PPIs) được xác định là 500 ng/ml Giá trị này đảm bảo độ đúng và độ chính xác theo quy định của FDA, dựa trên kết quả phân tích độ lệch chuẩn và độ dốc của đường tuyến tính.

Đề tài khảo sát các phương pháp xử lý mẫu huyết tương, bao gồm tủa protein có kiềm hóa và chiết lỏng - lỏng Kết quả cho thấy cả hai phương pháp này đều đạt tỷ lệ thu hồi tương đương.

So sánh giá trị hiệu suất chiết của hai phương pháp chiết khác nhau cho thấy không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Phương pháp chiết lỏng - lỏng phức tạp, sử dụng hóa chất độc hại và không thân thiện với môi trường, trong khi phương pháp tủa protein đơn giản, ít tốn kém và sử dụng methanol - huyết tương (tỷ lệ 1:4) Phương pháp tủa protein yêu cầu lượng mẫu nhỏ (chỉ 400 µl huyết tương cho một lần phân tích), thuận lợi và tiết kiệm trong công tác lấy mẫu và bảo quản Sau khi tủa protein, mẫu huyết tương được ly tâm, ít ảnh hưởng đến chất phân tích, và máy có thể ly tâm nhiều mẫu cùng lúc trong thời gian ngắn (15 phút) Do đó, phương pháp tủa protein bằng methanol có kiềm hóa đã được chọn để xử lý mẫu huyết tương.

Hiệu suất chiết của phương pháp thu được đạt yêu cầu của FDA với tỷ lệ thu hồi trung bình cho các lô mẫu LQC 1000 ng/ml và HQC 5000 ng/ml lần lượt là 83,11 % và 89,36 % cho PPZ; 86,21 % và 92,34 % cho OPZ; 89,48 % và 97,15 % cho RPZ; 91,48 % và 97,15 % cho LPZ RSD của tất cả các lô mẫu không vượt quá 15 %, dao động từ 4,77 % đến 13,02 %.

Định dạng
Số trang	152
Dung lượng	7,97 MB