(LUẬN văn THẠC sĩ) khảo sát thành phần hóa học phân đoạn a5 cao chloroform rễ cây hà thủ ô trắng streptocaulon juventas

TỔNG QUAN

ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

Tên thông thường: Hà thủ ô trắng

Hà thủ ô, còn được biết đến với nhiều tên gọi khác như bạch hà thủ ô, củ vú bò, dây sữa bò, và cây sừng bò, là một loại thảo dược quý Tại một số vùng, nó còn mang các tên như khâu cần cà ở Thổ, khâu nước ở Lạng Sơn, mã liên an, mã lìn ón, và khua mak tang ning ở Lào Tại Thái, loại cây này được gọi là chừa ma sìn.

Tên khoa học: Streptocaulon juventas (Lour) Merr

Thuộc họ Thiên lý (Asclepiadaceae)

Hình 1.1 Cây và củ Hà thủ ô trắng 1.1.1 Mô tả chung

Hà thủ ô trắng là một loại dây leo có chiều dài từ 2 đến 5m, với thân và cành có màu đỏ hoặc nâu đỏ và nhiều lông, khi già sẽ nhẵn dần Lá của cây mọc đối, có hình mác dài với đầu nhọn và đáy tròn, mặt dưới lá có lông mịn nhiều hơn so với mặt trên Kích thước phiến lá dao động từ 4-14 cm chiều dài và 2-9 cm chiều rộng, cuống lá dài từ 5-8 cm cũng có lông Hoa của cây có màu nâu nhạt hoặc vàng tía, mọc thành xim và cũng có nhiều lông Quả đại của cây tách đôi ngang, hình dạng giống như sừng bò, quả có hình thoi màu xám, dài từ 7-11 cm và rộng 8 mm Hạt của hà thủ ô trắng có hình dẹt, phồng ở lưng, dài từ 5-7 mm và rộng 2 mm, với chùm lông mịn dài 2 cm.

Toàn cây bấm thân, lá, quả non chỗ nào cũng ứa ra thứ nhựa trắng nhƣ sữa

Rễ củ dài mẫm và trắng, giữa có lõi trông nhƣ củ sắn nhƣng có vị đắng [1]

Cây Hà thủ ô trắng thường mọc hoang dã ở các vùng đồi núi trọc của Việt Nam, đặc biệt ưa thích những khu vực đất đồi cứng như Vĩnh Phúc, Hà Tây, Hà Giang, Tuyên Quang, Cao Bằng và Lạng Sơn.

Ngoài ra, cây còn mọc ở Trung Quốc, Campuchia, Ấn Độ, Indonesia, Lào, Myanmar, Thái Lan.

CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƢỢC TÍNH

1.2.1 Dƣợc tính theo y học cổ truyền

Cây Hà thủ ô trắng làm cho người già trẻ lại, giúp cho sự giao hợp được bền lâu, tóc bạc hóa đen

Người ta dùng củ và thân lá cây chữa cảm sốt, cảm nắng, sốt rét [1]

Dịch trích từ rễ cây Hà thủ ô trắng có tác dụng giải độc, chữa cảm sốt, giảm sưng đau và hỗ trợ điều trị vết thương do rắn cắn Ngoài ra, nó còn được sử dụng như một loại thuốc bổ cho các bệnh lý khác như thấp khớp, suy nhược thần kinh và chứng khó tiêu.

1.2.2 Nghiên cứu về dƣợc tính

Năm 2002, có nghiên cứu dùng cao chiết cồn đậm đặc của rễ củ Hà thủ ô trắng tăng cholesterol ngoại sinh trên chuột [2]

Nghiên cứu cho thấy dịch chiết rễ cây Hà thủ ô trắng có khả năng ức chế mạnh mẽ các dòng tế bào ung thư, bao gồm ung thư cổ tử cung Hela, ung thư phổi A549, tế bào ung thư đại tràng chuột 26-L5, tế bào ung thư phổi chuột LLC, và các dòng tế bào ung thư ác tính chuột B16-BL6 Ngoài ra, dịch chiết cũng ảnh hưởng đến tế bào ung thư phổi lớn tế bào NCl-H460 và nguyên bào phổi thai nhi MRC-5, cùng với nhiều tế bào khối u khác như PC3, SMMC7721, và CNE.

Ngoài ra, trong dịch chiết của cây Hà thủ ô trắng có thể ức chế sự phát triển của tế bào ung thư bạch cầu HL-60 ở người đáng kể [14].

CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Bảng 1.1 Các nghiên cứu về thành phần hóa học

21 acovenosigenin A digitoxoside (1), digitoxigenin gentiobioside (2), digitoxigenin 3-O- [O-β-D-glucopyranosyl-

(1 → 6)–O-β-D-glucopyranosyl-(1 → 4)-3-O-acetyl-β-D- digitoxopyranoside] (3), digitoxigenin 3-O-[O-β-D- glucopyranosyl-(1 → 6)–O-β-D-glucopyranosyl-(1 → 4)–O- β-D-digitalopyranosyl-(1 → 4)–β-D-cymaropyranoside] (4), periplogenin 3-O-(4-O-β-D-glucopyranosyl-β-D- digitalopyranoside) (5), (4R)-4-hydroxyl-3- (1- metyletyl)pentyl rutinoside (6), (R)-2-etyl-3-metylbutyl rutinoside (7), acovenosigenin A (8), periplogenin 3-O-β- digitoxoside (9), periplocymarin (10), periplogenin (11), digitoxigenin (12), digitoxigenin 3-O-[O-β- D - glucopyranosyl-(1 → 6)–O-β-D-glucopyranosyl-(1 → 4)–β-

D-digitoxopyranoside] (13), digitoxigenin sophoroside (14), echujin (15), periplogenin glucoside (16), corchorusoside C

(17), subalpinoside (18), acid caffeic (19), 4,5-di-O- caffeoylquinic acid (20), 2-phenylethyl rutinoside (75) [6]

12 periplogenin - 3β-acetate (21), -amyrol acetate (22), - amyrol tridecanoate (23), ursolic acid (24), 9,19-cyclolart-25- en-3β,24R-diol (25), 9,19-cyclolart-25-en-3β,24S-diol (26), cycloeucalenol (27), 9,19-cycloart-23E-en-3 β, 25-diol (28),

25-methoxy-9,19-cycloart-23E-en-3 β-ol (29), 11,12- epoxytaraxer-14-en-3β-acetate (30), oleanolic acid (76), uzarigenin (77) [8]

17β-H-Periplogenin 3-O-β- D -digitoxoside (31), ∆ 5 -Pregnene- 3β,16α-diol 3-O-[2,4-O-diacetyl-β-D- digitalopyranosyl(1→4)-β-D-cymaropyranoside]- 16-O-[β-D- glucopyranoside] (32) [9]

Zhinhui Liu cùng cộng sự

9 β –sitosterol (33), syringaldehyde (34), acid syringic (35), isofraxidin (36), scopoletin (37), scoparone (38), acid ferulic

17-H-periplogenin-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-acetyl- β-D-digitalopyranoside (42), oleandrin (43), oleandrigenin-3-

2013 Rui Xue và cộng sự 15

1-14β-dihudroxy-5β-card-20 (22)-enolide 3-O-[O-β-D- digitalopyranoside] (48), acovenosigenin A 3-O-[O-β-D- glucopyranosyl-(1→4)-β-D-digitalopyranoside] (49), 16-O- acetyl-hdroxyperiplogenin 3-O-β-D-digitoxopyranoside (50),

16-O-acetyl-hydroxyacovenosigenin (51), 3-O-(β- glucopyranosyl) acovenosigenin A (52), evonogenin (53), glucoevonogenin (54), digitoxigenin 3-O-[O-β-D- glucopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O- acetyl-β-D- digitalopyranoside] (55), digitoxigenin (56), digitoxigenin 3-O-β-D-glucoside (57) echunbioside (58), 1β, 3β, 14β-trihydroxy-5β-card-16,20 (22)-dienolide (59), griffithigenin (60), ∆(16) -digitoxigenin

2015 Chun Ye và cộng sự 9 periplogenin 3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-O-β-D- glucopyranosyl-(1→4)-2-O-acetyl-β-D-digitalopyranoside]

(65), 16-O-acetyl-hydroxyacovenosigenin 3-O-[O-β- D - glucopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O- acetyl-β-D-digitalopyranoside] (66), acovenosigenin A 3-O-

[O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-O-β- D-glucopyranosyl- (1→4)-O-β-D-digitalopyranosyl-(1→4)-β-D- cymaropyranoside] (67), digitoxigenin 3-O-β- D -cellobioside

(68), digitoxigenin-3-O-β-D-glucosyl-(1→4)-3-O-acetyl-β- D - digitoxoside (69), 5β-Hydroxygitoxigenin (70) [4]

2017 Yi-Chao Ge và cộng sự 6

28, 29-nor-3β, 4β-dihydroxyl-9, 19-cycloartan-26-acid methylester (72), 30-nor-3-β-acetoxy-lupan-20-one (73), - amyrin (79), betulinic acid (80), lupeol palmitate (81) [13]

Các công thức cấu tạo của một số hợp chất trong cây Streptocaulon juventas (Lour) Merr

THỰC NGHIỆM

HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP

Silica gel 37 – 63 μm, Himedia dùng cho sắc kí cột

Sắc kí lớp mỏng loại DC - Alufolein 20×20, Kiesel gel 60 F

Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: hexane, chloroform , ethyl acetate, ethanol, methanol, n-butanol và nước cất

Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên lớp mỏng: dung dịch H 2 SO 4 20%

Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu

Máy cô quay chân không

Bếp cách thuỷ Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm

Phương pháp phân lập các hợp chất

Cô lập các hợp chất hữu cơ có thể thực hiện thông qua các phương pháp sắc kí, bao gồm sắc kí cột silica gel pha thường, pha đảo và sắc kí lớp mỏng Quá trình này được hiện hình bằng đèn tử ngoại với hai bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc sử dụng thuốc thử là dung dịch H2SO4 20%.

Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR (500 MHz) và 13 C-NMR (125 MHz) cùng với 2D-NMR đã được ghi lại trên máy Bruker Avance tại phòng NMR, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, địa chỉ số 18, Hoàng Quốc Việt, Quận Cầu Giấy, Hà Nội.

NGUYÊN LIỆU

Mẫu cây dùng trong nghiên cứu đề tài là rễ cây Hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas (Lour) Merr.) đƣợc thu hái ở Tịnh Biên tỉnh An Giang vào tháng 10 năm 2016

Cây được Th.S Hoàng Việt từ trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh xác định danh tên khoa học là “Streptocaulon juventas”, thuộc họ Thiên lý (Asclepiadaceae).

2.2.2 Xử lý mẫu nguyên liệu

Mẫu nguyên liệu đƣợc rửa sạch, loại bỏ sâu bệnh, phơi khô trong bóng râm, rồi xay thành bột mịn.

ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO

Bột rễ cây Hà thủ ô được chiết xuất bằng cách đun hoàn lưu với dung môi methanol ở nhiệt độ từ 64-65 độ C, thực hiện 3 lần trong mỗi mẻ, mỗi lần kéo dài 2 giờ Sau khi lọc, dịch chiết thu được sẽ được cô quay ở áp suất thấp để thu cao methanol thô.

Cao methanol thô đƣợc chiết lỏng – lỏng với dung môi chloroform, cô quay dịch chiết thu đƣợc cao chloroform Quá trình thực hiện đƣợc tóm tắt theo sơ đồ 2.1

Sơ đồ 2.1 Quy trình điều chế cao chloroform từ rễ cây Hà thủ ô trắng

Bột thô rễ Hà thủ ô

- Đun hoàn lưu với methanol (3 lần x 2 giờ)

- Cô quay thu hồi dung môi ở áp suất thấp

- Chiếc lỏng-lỏng lần lƣợt với các dung môi choloroform; ethyl acetate và n-butanol

- Cô quay thu hồi dung môi ở áp suất thấp.

CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO CHLOROFORM

2.4.1 Sắc kí cột silica gel trên cao chloroform

Cao chloroform 400g được xử lý bằng phương pháp sắc ký cột (SKC) với silica gel, sử dụng hệ dung môi H:EA có độ phân cực tăng dần từ 0% đến 100% EA Sau đó, mẫu được giải ly nhiều lần với các hệ dung môi khác nhau như EA:Me 9:1, EA:Me:H2O 8:1:1, EA:Me:H2O 4:1:1, EA:Me:H2O 2:1:1 và cuối cùng là 100% EA.

Me Kết quả thu được mười ba phân đoạn ký hiệu từ A1 đến A13

Bảng 2.1 Sắc kí cột silica gel trên cao chloroform

STT Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lƣợng

Sắc kí lớp mỏng Ghi chú

1 A1 H 3.6 Nhiều vết Chƣa khảo sát

2 A2 H: EA 99:1 5.0 Nhiều vết Chƣa khảo sát

3 A3 H:EA 95:5 5.6 Nhiều vết Đã khảo sát

4 A4 H:EA 9:1 8.4 Nhiều vết Chƣa khảo sát

5 A5 H:EA 85:15 6.0 Nhiều vết Khảo sát

6 A6 H:EA 8:2 8.4 Nhiều vết Chƣa khảo sát

7 A7 H:EA 1:1 13.0 Nhiều vết Chƣa khảo sát

8 A8 EA 19.6 Nhiều vết Chƣa khảo sát

9 A9 EA:Me 9:1 26.8 Nhiều vết Chƣa khảo sát

10 A10 EA:Me:H 2 O 8:1:1 31.0 Nhiều vết Chƣa khảo sát

11 A11 EA:Me:H 2 O 4:1:1 41.2 Nhiều vết Chƣa khảo sát

12 A12 EA:Me:H 2 O 2:1:1 53.0 Vệt dài Chƣa khảo sát

13 A13 Me 71.6 Vệt dài Chƣa khảo sát

2.4.2 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn A5 của bảng 2.1

Phân đoạn A5 (6.0 gam) chứa nhiều vết và tách rõ, được thực hiện SKC silica gel Quá trình giải ly sử dụng hệ dung môi Hexane:Ethanol với độ phân cực tăng dần.

Tiến hành các bước tương tự như khi sắc kí cột phân đoạn trước Kết quả thu được năm phân đoạn phụ ký hiệu từ A5.1 đến A5.5

Bảng 2.2 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn A5

STT Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lƣợng

Sắc kí lớp mỏng Ghi chú

1 A5.1 H 960 Nhiều vết Chƣa khảo sát

2 A5.2 H:Et 100:1 882 Nhiều vết Chƣa khảo sát

3 A5.3 H:Et 50:1 798 Nhiều vết Chƣa khảo sát

4 A5.4 H:Et 19:1 950 Nhiều vết Khảo sát

5 A5.5 H:Et 9:1 940 Nhiều vết Chƣa khảo sát

2.4.3 Sắc kí cột pha đảo trên phân đoạn A5.4 của bảng 2.2

Phân đoạn A5.4 cho thấy sự tách biệt rõ ràng với SKLM Qua quy trình SKC pha đảo nhiều lần với cột C-18 và hệ dung môi MeOH:H2O 9:1, chúng tôi đã thu được hợp chất SJ1, có hình dạng tinh thể kim, không màu và tan hoàn toàn trong methanol Quá trình thực hiện được tóm tắt trong sơ đồ 2.2.

Sơ đồ 2.2 Quy trình cô lập hợp chất

- Sắc kí cột silica gel

- Giải ly H:EA, EA:Me:H 2 O

- Cô quay thu hồi dung môi

- Sắc kí cột silica gel

- Sắc kí cột pha đảo, C-18