TỔNG QUAN
Cấu trúc DNA
Acid nucleic trong tế bào bao gồm hai dạng chính: deoxyribonucleic acid (DNA) và ribonucleic acid (RNA) Trong đó, RNA chiếm khoảng 90% tổng lượng acid nucleic, trong khi DNA chỉ chiếm phần còn lại.
Theo Watson-Crick DNA có các đặc điểm sau:
DNA là một cấu trúc gồm hai chuỗi song song xoắn quanh một trục trung tâm theo chiều xoắn phải, với đường kính 20 Å (1 Angstrom = 10^-10 m) Cấu trúc này có nhiều vòng xoắn lặp lại đều đặn, mỗi vòng cao 34 Å, tương ứng với 10 cặp base (hay còn gọi là nucleotide).
Các bộ khung đường-phosphate được phân bố ở mặt ngoài của chuỗi xoắn, trong khi các base nằm ở bên trong Chúng được sắp xếp trên các mặt phẳng song song và vuông góc với trục phân tử, với khoảng cách trung bình là 3,4 Å.
Hai sợi đơn trong DNA liên kết với nhau qua các mối liên kết hydro yếu, hình thành giữa các cặp base đối diện theo nguyên tắc bổ sung "một purine - một pyrimidine" Trong DNA, chỉ có hai kiểu kết cặp base đặc trưng: A-T với hai liên kết hydro và G-C với ba liên kết hydro.
(4) Tính chất bổ sung theo cặp base dẫn đến sự bổ sung về trình tự các base giữa hai sợi đơn của mỗi chuỗi xoắn kép
Hình 1.5 Các mô hình cấu trúc chuỗi xoắn kép [39]
Có bốn loại base là Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) và Thymin (T)
DNA là thành phần hóa học chính cấu tạo nên nhiễm sắc thể, trong đó mỗi đoạn DNA đảm nhận một chức năng nhất định trong việc truyền tải thông tin di truyền, được gọi là gen.
Dấu vân tay DNA
Phương pháp này phân tích các trình tự base lặp lại để phát hiện sự khác biệt giữa các cá nhân, đồng thời xác định mối quan hệ huyết thống giữa họ.
DNA của mọi sinh vật đều tương đồng, với sự khác biệt duy nhất giữa các cá thể trong cùng một loài nằm ở trình tự các cặp base Mỗi cá nhân có hàng tỉ cặp base trong DNA, dẫn đến sự khác biệt trong trình tự base giữa các người.
Mỗi cá thể có thể được nhận dạng duy nhất thông qua trình tự các cặp base trong DNA Tuy nhiên, do số lượng cặp base quá lớn, việc này trở nên khó khăn Thay vào đó, các nhà khoa học sử dụng phương pháp đơn giản hơn, dựa vào các mô hình lặp lại trong DNA để xác định danh tính cá thể.
Quá trình phát triển kỹ thuật xác định dấu vân tay DNA trong hơn 20 năm đã mở ra ứng dụng định kiểu DNA trong pháp y, đặc biệt là việc nghiên cứu các đoạn trình tự DNA lặp lại Những đoạn này chiếm khoảng 3% bộ gen người và được phân thành hai nhóm chính: tiểu vệ tinh (minisatellites) và vi vệ tinh (microsatellites).
Tiểu vệ tinh, hay còn gọi là VNTRs, là các trình tự lặp lại có độ dài biến thiên, với các đơn vị lặp lại từ 6bp đến hơn 100bp Những VNTR locus này thường tạo thành các đoạn dài hàng kilobase, và chúng có sự phong phú về cấu trúc, đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu di truyền và phân tích gen.
GC thường tập trung thành các nhóm trong vùng tái tổ hợp gần đầu nhiễm sắc thể Một số tiểu vệ tinh chứa đoạn trình tự “GGGCAGGANG”, cho thấy sự liên kết chéo giữa purines và pyrimidines của hai mạch đơn DNA Trình tự này được đề xuất là hỗ trợ cho các nhiễm sắc thể trong việc trao đổi DNA Trong các mô hình thay thế, sự hiện diện của sợi đôi lân cận trong quá trình phân bào giảm nhiễm có thể gây ra sự phá vỡ điểm tới hạn, dẫn đến biến thể số lượng bản sao lặp lại trong tiểu vệ tinh Những thay đổi trong tế bào soma được cho là kết quả của những khó khăn trong quá trình sao chép.
Chương 1 Tổng quan tài liệu
Trang 5 bao gồm trượt trong quá trình sao chép và một số hiện tượng khác) Khi các sự kiện như vậy xảy ra sẽ kéo theo những lỗi lặp, tạo ra các tiểu vệ tinh tại hơn 1.000 vị trí trong bộ gen người, từ đó dẫn đến những sự lặp lại khác nhau, tạo nên nét đặc trưng riêng cho từng cá thể [47]
Năm 1984, Alec Jeffreys đã phát hiện ra vùng locus tiểu vệ tinh siêu biến bằng kỹ thuật MLPs, mở ra công cụ mới cho điều tra pháp y Tuy nhiên, MLPs yêu cầu lượng DNA lớn và chất lượng cao, thường không khả thi trong các trường hợp pháp y do mẫu DNA thường ít và kém chất lượng Để khắc phục, kỹ thuật SLPs đã được phát triển, sử dụng tiểu vệ tinh đã được dòng hóa để tạo ra “hồ sơ DNA” đơn giản hơn, phù hợp cho điều tra tội phạm Mỗi SLP phát hiện một tiểu vệ tinh, tạo ra hai vạch nhưng vẫn duy trì độ đa hình cao nhờ nhiều tiểu vệ tinh siêu biến SLPs có độ nhạy cao hơn MLPs, có thể phát hiện DNA ở mức 10ng, giúp phân tích mẫu hỗn hợp dễ dàng hơn Tuy nhiên, việc xác định kích thước alen SLP vẫn gặp khó khăn do giới hạn của điện di gel agarose, và tần suất alen cũng không được tính toán từ năm 1996.
Một số vị trí tiểu vệ tinh có alen ngắn (0,9 và dị hợp tử >0.7
+ Tách biệt vị trí trên nhiễm sắc thể tránh trường hợp liên kết vùng gen
+ Cho kết quả rõ ràng khi chạy phản ứng multiplex
+ Đặc tính tạo stutter thấp
+ Tỷ lệ đột biến thấp
+ Chiều dài của các alen ước đoán nằm trong khoảng 90-500bp với kích thước nhỏ hơn, phù hợp cho việc phân tích các mẫu DNA thoái hoá
Chương 1 Tổng quan tài liệu
Trang 15 Để thuận tiện, các marker STR điển hình ứng dụng trong hồ sơ DNA thường được thiết kế trên các nhiễm sắc thể riêng biệt nhằm tránh những rắc rối do sự liên kết giữa các marker
1.4.2 Những kit STR đã thương mại hóa
Năm 2001, Applied Biosystems đã giới thiệu hai kỹ thuật mới trong kit AmpFℓSTR®
Identifiler™ là một kỹ thuật sử dụng hệ thống phát hiện 5 màu huỳnh quang, trong đó 4 màu khác biệt (6FAM™, VIC™, NED™ và PET™) được áp dụng để đánh dấu các sản phẩm khuếch đại chính xác hơn 3 màu (5FAM, JOE, NED hoặc FL, JOE, TMR) trong các bộ kit AmpFℓSTR hoặc PowerPlex Kênh phát hiện 1 màu luôn được sử dụng làm kích thước nội chuẩn trong điện di để xác định rõ kích thước sản phẩm PCR Vì vậy, màu thứ 5 (LIZ™) trong hệ thống phát hiện 5 màu và màu thứ 4 (ROX hoặc CXR) trong hệ thống phát hiện 4 màu được dùng để đánh dấu kích thước nội chuẩn.
Hình 1.7 Mồi được gắn thêm đuôi hiệu chỉnh [4]
Kỹ thuật thứ hai trong bộ kit Identifiler™ sử dụng vùng hiệu chỉnh non-nucleotide, được cấu tạo từ hexaethyleneoxide (HEO) với mỗi đơn vị dài khoảng 2.5 nucleotide Các liên kết non-nucleotide này kết nối giữa màu huỳnh quang và đầu 5’ của trình tự mồi, giúp tạo ra amplicon trong quá trình khuếch đại Việc bổ sung các liên kết non-nucleotide trong quá trình điện di nâng cao khả năng phát hiện các alen STR.
Trang 16 kích thước lớn và rõ hơn, khoảng trống giữa các STR locus đã được đánh dấu cùng màu huỳnh quang được tối ưu hoá, không thay đổi vị trí gắn kết mồi PCR (Hình 1.7) [4].
Các kỹ thuật sử dụng trong việc tạo hồ sơ DNA
1.5.1 Đặc điểm 18 locus STR được khảo sát Để các marker trong hồ sơ DNA có giá trị pháp lý cao, các nhà nghiên cứu luôn phải sử dụng bộ marker chuẩn Hiện nay, các STR locus thông dụng thường mang nét đặc trưng và phát triển khởi đầu hoặc từ phòng thí nghiệm của tiến sĩ Thomas Caskey tại trường Y khoa Baylor [11]; [15] hoặc từ Sở Khoa học Pháp Y (FSS-Forensic Science Service) tại Anh [23]; [32] Promega (Madison, Wisconsin) thương mại hóa nhiều marker của Caskey trong khi Applied Biosystems (Foster City, California) lại chọn các STR locus của Sở Khoa học Pháp Y (FSS) để phát triển một số marker mới
Tên của marker STR được xác định dựa trên vị trí của nó, nằm trong hoặc ngoài một gen Khi marker nằm trong vùng gen chức năng hoặc là một phần của gen, tên của gen sẽ được sử dụng để đặt tên cho marker.
TH01 trong đó TH là viết tắt từ tên gen tyrosine hydroxylase nằm trên nhiễm sắc thể
Vùng intron đầu tiên của gen 11 và số 01 chứa các đoạn lặp lại [AATG] và [TCAT] tại vị trí 15.5 trên cánh ngắn nhiễm sắc thể thứ 11 (11p15.5) Trong khi đó, đoạn DNA vWA bao gồm các kiểu lặp lại [AGAT], [TCTA], [TCTG] và [TCCA], nằm trong intron thứ 40 của nhân tố von Willebrand, tại vị trí 13.31 trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể thứ 12 (12p13.31).
TPOX là một marker gen có kiểu lặp lại [AATG], nằm trong intron thứ 10 của gen thyroid peroxidase, thuộc vị trí 2p25.3 trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể thứ 2.
CSF1PO là vùng DNA chứa kiểu [AGAT] thuộc intron thứ 6 của gen c-fms proto- oncogen for CSF-1 receptor nằm trong vạch 33.1 của cánh dài nhiễm sắc thể 5 (5q33.1)
Chương 1 Tổng quan tài liệu
FGA là STR marker kiểu [TTTC] 3 TTTTTTCT[CTTT] n CTCC[TTCC] 2 nằm trong intron thứ 3 của genalpha fibrinogen thuộc vạch phụ số 3 trong vạch 31 nhánh dài của nhiễm sắc thể 4 (4q31.3) [5]
Các STR nằm ngoài vùng gen chức năng được đặt tên theo thứ tự trên nhiễm sắc thể Cụ thể, chữ ‘D’ đại diện cho DNA, theo sau là số thứ tự của nhiễm sắc thể, tiếp theo là ‘S’ viết tắt cho single copy sequence (trình tự lặp đơn), và cuối cùng là số thứ tự của marker được phát hiện Ví dụ, D16S539 có nghĩa là D: DNA, 16: nhiễm sắc thể 16, S: trình tự đơn, và 539 là số thứ tự của locus thứ 539 trên nhiễm sắc thể 16.
D3S1358 locus thứ 1358 được phát hiện và mô tả trên nhiễm sắc thể 3, chứa kiểu lặp lại của [AGAT], [TCTA]thuộc vạch 21.31 trên nhánh ngắn [45]
D7S820 nằm trên nhiễm sắc thể 7, locus thứ 820 và có đoạn lặp lại kiểu [GATA], thuộc vạch 21.11 trên nhánh dài [45]
D5S818 là một đoạn DNA với kiểu lặp lại [AGAT], được xác định là locus thứ 818 trên nhiễm sắc thể 5, tại vị trí 23.2 trên nhánh dài của nhiễm sắc thể này.
D8S1179 là marker chứa kiểu lặp lại [TATC] , thuộc vạch 24.13 của nhánh dài trên nhiễm sắc thể 8 và ở locus 1179 [45]
D13S317 locus thứ 317 được phát hiện và mô tả trên nhiễm sắc thể 13, chứa kiểu lặp lại của [GATA], [TATC] thuộc vạch 31.1 trên nhánh ngắn [45]
D21S11 là một đoạn DNA có chứa các kiểu lặp lại [TCTA] và [TCTG] Số 11 chỉ vị trí thứ 11 của locus được phát hiện và mô tả trên nhiễm sắc thể 21, nằm ở vị trí 21.1 trên nhánh dài của nhiễm sắc thể này.
D18S51 là marker chứa kiểu lặp lại [GAAA] , thuộc vạch 21.33 của nhánh dài trên nhiễm sắc thể 18 và ở locus 51 [45]
D19S433 là STR marker kiểu [AGAT],[TCTA] thuộc vạch 12 trên nhánh dài nhiễm sắc thể 19 và ở locus 433 [45]
D2S1338 là đoạn DNA chứa kiểu lặp lại [TGCC] n ,[TTCC] n , thuộc vạch 35 của nhánh dài trên nhiễm sắc thể 2 và ở locus 1338 [45]
Penta E là đoạn DNA chứa kiểu lặp [AAAGA], thuộc vạch 26.2 của nhánh dài trên nhiễm sắc thể 15 [12], [45]
Penta D là đoạn DNA chứa kiểu lặp [AAAGA], thuộc vạch 22.3 của nhánh dài trên nhiễm sắc thể 21 [12], [45]
Hình 1.8 Bảng 13 tiêu chuẩn CODIS [43]
Trình tự STR có sự đa dạng về chiều dài và số lượng đơn vị lặp, đồng thời tuân theo quy luật nhất định để hình thành các mẫu khác nhau Các kiểu phân nhóm STR bao gồm: (i) Đơn vị lặp đơn với lõi lặp đồng nhất về chiều dài và trình tự; (ii) Đơn vị lặp ghép, bao gồm ít nhất hai đơn vị lặp đơn; (iii) Đơn vị lặp phức, chứa các đoạn lặp có chiều dài và trình tự biến động; (iv) Đơn vị lặp phức siêu biến với các alen không đồng nhất về chiều dài và trình tự Mặc dù kiểu STR phức siêu biến không được sử dụng phổ biến trong định kiểu DNA pháp y, nhưng ngay cả đơn vị lặp đơn cũng có thể chứa các alen với lõi lặp không hoàn chỉnh.
Chương 1 Tổng quan tài liệu
Hình 1.9 Các kiểu trình tự lặp của STR [46]
1.5.2 Kỹ thuật multiplex PCR-STR Đây là kỹ thuật cao đòi hỏi phải có quá trình tối ưu hóa, tiêu tốn nhiều thời gian, công sức và tiền bạc nhưng nó mang lại ưu thế và sự tiện lợi rất lớn cho ứng dụng thực tiễn lâm sàng cũng như pháp y Trong lĩnh vực pháp y, kỹ thuật đa mồi được Applied Biosystems và Promega ứng dụng thành bộ kit hoàn chỉnh Với chỉ 1 lần chạy phản ứng khuếch đại, các phòng thí nghiệm có thể thu được hồ sơ DNA cá thể với 16 vùng STR trên các nhiễm sắc thể khác nhau với độ chính xác rất cao
Sự phát triển của các kit khuếch đại STR multiplex đã tạo ra bước ngoặt quan trọng trong khoa học pháp y DNA Kit STR multiplex thế hệ đầu tiên do FSS phát triển có 4 locus TH01, FES/FPS, VWA và F13A1, với khả năng đối chiếu khoảng 1:10,000 Tiếp theo, FSS giới thiệu kit STR multiplex thế hệ thứ hai, bao gồm marker xác định giới tính và 6 STRs đa hình TH01, VWA, FGA, D8S1179, D18S51, D21S11, nâng cao khả năng đối chiếu lên khoảng 1:50,000,000 Hiện nay, thị trường cung cấp nhiều kit cho phép khuếch đại đồng thời đến 16 marker STR trong một phản ứng với chỉ 1ng DNA (hoặc ít hơn), khả năng phân biệt đạt đến 1:10^17 và cho kết quả chỉ trong vài giờ.
1.5.3 Kỹ thuật điện di mao quản tự động
Hệ thống điện di mao quản tự động bao gồm ống mao quản, hai lọ dung dịch đệm, hai điện cực kết nối với nguồn điện cao (5-20kV), nguồn kích thích laser, đầu dò huỳnh quang, khay mẫu tự động và máy tính Ống mao quản làm từ silica nóng chảy, có đường kính 50-100µm và chiều dài 25-75 cm Trong giám định hồ sơ DNA hiện nay, hệ thống điện di đa mao quản thường được sử dụng để đạt được kết quả nhanh chóng.
Hình 1.10 Kỹ thuật điện di mao quản tự động [4]
1.5.4 Kỹ thuật phân tích hồ sơ DNA
Trong quá trình khuếch đại các alen STR, việc phân tích và diễn giải kiểu hình của các alen trong mẫu DNA thường gặp khó khăn do hiện tượng như stutter products và non-template addition Bên cạnh đó, các yếu tố khác như microvariants, tri-allelic patterns, alen dropout và mutation cũng có thể ảnh hưởng đến kết quả hồ sơ DNA.
• Các sản phẩm lặp (Stutter products):
Chương 1 Tổng quan tài liệu
Hình 1.11 Hình ảnh stutter của một vài alen [4]
Cơ chế giải thích sự xuất hiện các sản phẩm lặp lại trong PCR liên quan đến hiện tượng bắt cặp lỗi trượt-sợi (slipped-strDNA mispairing) Khi một vùng của phức hợp primer-template không bắt cặp, mồi hoặc sợi khuôn có thể tạo thành vòng non-base-paired Kết quả là, các sản phẩm PCR sẽ có kích thước ngắn hơn so với alen STR ban đầu, giảm đi một đơn vị lặp lại đơn.
Hình 1.12 Cơ chế liên quan việc hình thành đỉnh phụ nhỏ [4]
Các stutter có thể gây khó khăn trong việc giải thích kết quả hồ sơ DNA, đặc biệt khi nhiều cá thể có thể đã đóng góp vào mẫu DNA Việc phân biệt giữa các sản phẩm stutter và các sản phẩm PCR thực trở nên phức tạp khi chúng có kích thước tương tự nhau, dẫn đến khó khăn trong việc xác định đâu là stutter của alen kế cận và đâu là đỉnh alen thực Một số nét nhận dạng stutter có thể được tóm tắt như sau.
- Một đỉnh nhỏ và xuất hiện ngay trước đỉnh alen chính tương ứng ;
- Tỷ lệ phần trăm chiều cao giữa đỉnh stutter và đỉnh alen tương ứng với nó thường thấp hơn 15%
- Lượng stutter tùy thuộc vào loại locus cũng như điều kiện PCR và polymerase đã sử dụng ;
- Xu hướng các stutter sẽ giảm xuất hiện với các đơn vị lặp lại dài hơn (pentanucleotides