Kỹ thuật hóa sinh hiện đại trong phân tích chất lượng thực phẩm

Kỹ thuật hóa sinh hiện đại trong phân tích chất lượng thực phẩm Kỹ thuật hóa sinh hiện đại trong phân tích chất lượng thực phẩm Kỹ thuật hóa sinh hiện đại trong phân tích chất lượng thực phẩm Kỹ thuật hóa sinh hiện đại trong phân tích chất lượng thực phẩm Kỹ thuật hóa sinh hiện đại trong phân tích chất lượng thực phẩm Kỹ thuật hóa sinh hiện đại trong phân tích chất lượng thực phẩm

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HIGH

Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng

Sắc ký lỏng là quá trình tách chất diễn ra trên cột tách, với pha tĩnh là chất rắn hoặc lỏng và pha động là chất lỏng Mẫu phân tích được đưa lên cột dưới dạng dung dịch, và trong quá trình chạy sắc ký, các chất phân tích sẽ phân bố giữa hai pha Do sự khác biệt về cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa của các chất, khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động cũng khác nhau, dẫn đến việc chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và được tách ra một cách hiệu quả.

Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.2.1 Pha động trong sắc ký lỏng

Pha động hoặc chất rửa giải là dung môi có độ tinh khiết cao hoặc hỗn hợp các dung môi

Các chất phụ gia như muối, axit, bazơ, thuốc thử, cũng có thể được hòa tan trong pha động và phải tan hoàn toàn

Chất rửa giải cần được lọc qua màng 0,45μm để loại bỏ các hạt mịn lớn hơn 0,5μm Việc này không được can thiệp vào phương pháp phát hiện; ví dụ, khi sử dụng máy dò UV, pha động phải trong suốt về mặt quang học tại bước sóng đã chọn.

Nên chọn dung môi chuyên dụng cho máy HPLC, bao gồm cả nước, một thành phần quan trọng trong chất rửa giải, cần đạt tiêu chuẩn HPLC nếu không có hệ thống lọc nước siêu tinh khiết Ngoài ra, các chất phụ gia cũng cần phải tương thích với máy dò để đảm bảo hiệu suất tối ưu.

Pha động có thể chia làm 2 loại:

Pha động có độ phân cực cao chủ yếu chứa nước, nhưng để phân tích các chất hữu cơ hiệu quả, cần bổ sung dung môi nhằm giảm độ phân cực Loại pha động này thường được sử dụng trong sắc ký pha ngược.

Pha động có độ phân cực thấp bao gồm các dung môi như cyclopentan, n-pentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS2), CCl4, và toluene Để tách một nhóm chất, thường cần phối hợp 2 hoặc 3 dung môi để tạo ra pha động có độ phân cực phù hợp với yêu cầu phân tích Sự thay đổi thành phần pha động theo thời gian được gọi là gradient pha động.

1.2.2 Bộ phận khử khí (degasser)

Bộ khử khí là một phần của thiết bị HPLC Khử khí cho phép máy bơm và máy dò hoạt động bình thường

Khử khí là một bước quan trọng trong phân tích vết, giúp giảm nhiễu của đường cơ sở trong sắc ký đồ Quá trình này có thể thực hiện thông qua hệ thống chân không không dòng chảy với màng thấm khí hoặc bằng cách làm sạch bình chứa dung môi bằng heli.

Quá trình phân tách HPLC diễn ra ở áp suất từ 50 đến 300 bar (0,5–3 × 10^7 Pa), với tốc độ dòng chảy thường dao động từ 0,5 đến 2 ml/phút, hoặc chỉ 0,1 ml/phút khi sử dụng cột có lỗ hẹp.

Máy bơm cần đảm bảo cung cấp dòng pha động chính xác tại mọi tốc độ dòng, không có xung nhịp, bất kể độ nhớt của dung môi và áp suất ngược của cột.

Thể tớch mẫu thường sử dụng để phõn tớch bằng HPLC là từ 10 đến 100 àl.

Mẫu có thể được bơm thủ công vào van tiêm hoặc sử dụng bộ lấy mẫu tự động.

Bộ lấy mẫu tự động là thiết bị quan trọng trong hầu hết các hệ thống HPLC, cho phép phân tích mẫu hiệu quả Các mẫu được cho vào lọ nhỏ (khoảng 2 ml), đậy nắp và đặt vào giá đựng mẫu, trong đó có giá làm mát để bảo quản các mẫu không bền nhiệt Lượng mẫu tối thiểu cần thiết cho bộ lấy mẫu tự động dao động từ 10 àl đến 50 àl, tùy thuộc vào cấu tạo của lọ Tuy nhiên, không có thiết bị nào có khả năng bơm toàn bộ lượng chất lỏng trong lọ; một phần sẽ luôn được giữ lại.

Tiêm mẫu thủ công là một giải pháp hữu ích khi không đủ mẫu Thay vì sử dụng các lọ, người dùng có thể tiêm trực tiếp từ các đĩa giếng, miễn là có giá đỡ phù hợp.

Cột là thành phần thiết yếu của máy sắc ký, nơi diễn ra quá trình phân tách Nó được cấu tạo từ ống thép không gỉ với đường kính trong từ 2 đến 4,6 mm và chiều dài từ 5 đến 30 cm.

Cột HPLC được nhồi với các hạt có đường kính từ 3 đến 10 mm, thường sử dụng chất nhồi silicagen, silicagen bọc hoặc gắn hóa học với màng hữu cơ Ngoài silicagen, Al2O3, hạt polime xốp và hạt trao đổi ion cũng được sử dụng Các cột vi mô có đường kính trong nhỏ hơn 1 mm chỉ nên sử dụng với thiết bị HPLC vi mô chuyên dụng và được lắp đặt giữa van kim phun và đầu báo.

Hình 1.1 Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao

Hầu hết các cột đều không có hướng dòng chảy định trước nhưng một khi cột đã được sử dụng, dòng chảy không được đảo ngược

Tiền cột là bộ phận quan trọng trong hệ thống HPLC, được lắp giữa kim phun và cột nhằm bảo vệ cột khỏi bụi bẩn và các chất gây tắc nghẽn Với chi phí thấp, tiền cột có thể dễ dàng thay thế khi cần thiết Đặc biệt, trong nhiều quy trình phân tách, việc kiểm soát nhiệt độ cột hoặc làm việc ở nhiệt độ cao là rất cần thiết, do đó lò cột trở thành một phần tiêu chuẩn của nhiều thiết bị HPLC và có thể được lắp đặt thêm nếu cần.

Trong HPLC, mẫu được đưa vào một đầu cột và các đỉnh đã được tách sẽ xuất hiện ở đầu kia Vì nồng độ của các thành phần rất thấp và dải rửa giải hẹp, nên cần sử dụng thiết bị có độ tinh vi cao để phát hiện chúng.

Máy dò được sử dụng để đo các đặc tính quan trọng của chất rửa giải, như chiết suất và độ dẫn điện Hầu hết các máy dò được thiết kế để phát hiện các hợp chất dựa trên các đặc tính cụ thể của chúng Một số loại đầu dò phổ biến bao gồm UV/VIS, huỳnh quang, chỉ số khúc xạ, độ dẫn điện, điện hóa, tán xạ ánh sáng bay hơi cho các hợp chất không bay hơi, và máy dò phân cực.

Ngoài ra, có thể kết hợp trực tuyến HPLC với phổ khối MS hoặc phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR Thiết bị dò biến đổi hiện tượng quan sát thành tín hiệu điện, thường là điện áp.

1.2.7 Bộ xử lý dữ liệu

Phân tích bằng HPLC

Một peak sắc ký cho thấy sự hiện diện của hợp chất rửa giải chưa xác định Để nhận diện các chất phân tích hoàn toàn mới, cần áp dụng các kỹ thuật quang phổ, đặc biệt là khối phổ Việc kết hợp máy HPLC với các đầu dò như quang phổ là cần thiết để đạt được kết quả chính xác.

UV, MS và NMR cho phép làm sáng tỏ cấu trúc ngay lập tức

Trong nhiều trường hợp, việc xác định bản chất của các chất phân tích có thể thực hiện bằng cách tiêm chất chuẩn Sự đồng nhất giữa chất chuẩn và hợp chất chưa biết chỉ được khẳng định khi chúng có thời gian lưu giống nhau trong nhiều hệ thống phân tách khác nhau, như pha bình thường và pha đảo ngược hoặc pha đảo ngược và trao đổi ion.

Có thể sử dụng diện tích peak hoặc chiều cao peak để định lượng

Mối quan hệ giữa lượng chất phân tích và kích thước peak được mô tả qua hệ số đáp ứng thực nghiệm, do đó cần thực hiện phân tách hiệu chuẩn với nồng độ đã biết nếu cần định lượng Nếu peak của chất phân tích phân giải tốt khỏi các peak lân cận, có thể sử dụng hợp chất chuẩn tinh khiết Ngược lại, nên dùng chất đối chiếu hỗn hợp với lượng chất phân tích đã biết hoặc hòa tan hợp chất đối chiếu trong hỗn hợp nhân tạo để hiệu chuẩn trong điều kiện thực tế Đường chuẩn theo thể tích cần có 5–8 điểm tham chiếu với nồng độ khác nhau, và nồng độ chất phân tích dự kiến của mẫu nên nằm ở giữa dải hiệu chuẩn.

1.3.3 Phương pháp nội chuẩn Đối với nhiều phép phân tích định lượng, nên làm việc với chất nội chuẩn Đây là một hợp chất có độ tương đồng hóa học cao với các chất phân tích được quan tâm, ví dụ như đồng phân Do đó, nó sẽ hoạt động tương tự trong quá trình chuẩn bị mẫu và sắc ký

Chất nội chuẩn được bổ sung vào cả mẫu thử và mẫu tham chiếu với lượng giống nhau Dựa vào tỷ lệ khối lượng hoặc nồng độ đã biết của chất nội chuẩn và chất phân tích trong mẫu chuẩn, có thể xác định lượng thực tế của chất phân tích trong mẫu thông qua việc so sánh tỷ lệ kích thước peak.

Phương pháp này có khả năng bù đắp hiệu quả cho sự mất mát của chất phân tích trong quá trình chuẩn bị mẫu hoặc các vấn đề liên quan đến tiêm mẫu.

Chuẩn bị mẫu

Nhiều chế phẩm thuốc chứa các chất phân tích ở nồng độ khá cao và ở dạng hỗn hợp tương đối đơn giản

Các mẫu sinh học như máu, nước tiểu và mô chứa nhiều hợp chất, thường ở nồng độ thấp, làm cho việc tìm kiếm và định lượng chất phân tích trở nên khó khăn Để đạt được kết quả chính xác, cần thực hiện các bước chuẩn bị mẫu phức tạp nhằm phân lập và cô đặc các hợp chất cần thiết.

Hầu hết các quy trình HPLC không cho phép tiêm trực tiếp dịch cơ thể chưa qua xử lý do nguy cơ nhiễm bẩn hoặc tắc nghẽn cột Theo nguyên tắc chung, sau khi chuẩn bị mẫu, các chất phân tích cần được hòa tan trong pha động dùng cho tách HPLC, với yêu cầu tối thiểu là dung dịch mẫu phải hòa tan dễ dàng trong pha động.

Chiết lỏng – lỏng là phương pháp tách hai chất lỏng không hòa tan vào nhau có khả năng tách pha.

- Cho hỗn hợp mẫu vào phễu chiết (hoặc ống ly tâm, tùy theo lượng mẫu có được)

- Lắc đều và để yên để hỗn hợp tách pha.

+ Làm bay hơi dung môi hữu cơ

Sử dụng nước để chiết xuất thành pha nước, hòa tan chất phân tích vào dung môi hữu cơ, sau đó lắc dung dịch với đệm bazo Cuối cùng, áp dụng phương pháp sắc ký pha đảo hoặc trao đổi ion để tiến hành tách biệt các thành phần.

- Hòa tan chất cần phân tích vào dung môi pha động.

Hình 1.5 Quy trình chiết pha rắn

Bước 1: Chuẩn bị cột chiết (pha tĩnh là chất rắn, thường là silicagel, pha động là hỗn hợp dung môi A)

Bước 2: Cho mẫu vào cột chiết.

Bước 3: Các chất trong mẫu được hấp phụ vào cột.

Bước 4: Rửa giải các tạp chất hoặc chất ảnh hưởng bằng dung môi B.

Bước 5: Rửa giải chất phân tích bằng dung môi C.

Ưu và nhược điểm của phương pháp

- Khả năng định lượng tốt, độ chính xác cao

- Có khả năng định lượng đồng thời các chất có độ phân cực gần nhau

- Lượng mẫu phân tích nhỏ.

- Thời gian làm sạch và ổn định cột sau các lần chạy lâu

- Cột dễ bị nghẹt nếu không xử lý mẫu kỹ.

Sự cố và xử lý

Bộ phận của máy HPLC hoạt động kém

- Thay thế khóa của bơm Làm sạch van một chiều của bơm hoặc thay thế chúng.

- Kiểm tra tất cả các bộ phận xem có rò rỉ không

- Thay đèn UV hoặc đèn huỳnh quang sau khoảng thời gian được ghi trong sách hướng dẫn

- Di chuyển thiết bị đến nơi không làm ảnh hưởng đến điện trường, gió lùa, dao động nhiệt độ hoặc ánh nắng trực tiếp.

Pha động không được hòa trộn đều

- Đối với phân tách đẳng dòng, nên chuẩn bị dung dịch rửa giải trong một chai duy nhất thay vì trộn các thành phần trong thiết bị

Ngay cả khi sử dụng phương pháp phân tách gradient, có thể thấy rằng đường nền bị nhiễu thấp hơn nếu pha động ban đầu, chẳng hạn như hỗn hợp 80% nước với phụ gia và 20% dung môi hữu cơ, được chuẩn bị sẵn trong bình chứa A.

Bộ khử khí kém có thể gây ảnh hưởng tiêu cực đến quá trình phát hiện điện hóa Trong một số trường hợp, việc áp dụng quy trình khử khí hai bước, bao gồm helium kết hợp với chất khử khí màng, là rất cần thiết để đảm bảo hiệu quả.

Dung môi và thuốc thử phải tương thích với đầu dò

Để đảm bảo chất lượng tốt khi sử dụng, không nên chọn thuốc thử có khả năng tương thích hoàn hảo với tia UV cho việc phát hiện điện hóa, và ngược lại.

Trong nhiều trường hợp, việc không sử dụng hệ pha cho detector có thể dẫn đến các hiện tượng không mong muốn như xuất hiện các cực đại phụ hoặc cực đại âm, đặc biệt khi cần phát hiện tia cực tím ở bước sóng 210 nm hoặc thấp hơn.

Hằng số thời gian của máy dò quá thấp

Khi chọn hằng số thời gian cho lần tiếp theo, hãy ưu tiên chọn hằng số cao hơn Tuy nhiên, cần thận trọng với việc chọn hằng số quá cao, vì điều này có thể dẫn đến hiện tượng cắt đỉnh không mong muốn.

1.6.2 Trôi đường nền cơ sở

Trôi đường cơ sở là một kỹ thuật phổ biến trong phân tách gradient, với độ dốc phụ thuộc vào thành phần pha động và loại máy dò sử dụng Việc sử dụng thuốc thử và dung môi chất lượng cao là điều kiện cần thiết để đạt được kết quả chính xác Ngoài ra, cần lưu ý rằng một số nguyên tắc phát hiện, như phát hiện chỉ số khúc xạ, có thể không tương thích với phương pháp gradient.

Hiện tượng trôi có thể quan sát thấy khi nhiệt độ dao động, do sự thay đổi thành phần của các pha động đã trộn sẵn như bay hơi và khử khí heli quá mạnh Điều này xảy ra khi quá trình bơm không hoàn toàn hoặc thời gian cân bằng cột quá ngắn khi dung dịch rửa giải bị thay đổi.

Hình dạng đỉnh kém, đuôi mạnh, hoặc sự xuất hiện của các đỉnh kép cho thấy cột đã không còn phù hợp với mục đích sử dụng và cần được thay thế.

Hiện tượng nối đuôi trong hệ thống HPLC có thể xảy ra do thể tích cột phụ quá lớn, chẳng hạn như ống mao dẫn có đường kính lớn, phụ kiện kém chất lượng, hoặc kết nối không chặt giữa các bộ phận Ngoài ra, đầu dò có thể tích bên trong cao cũng có thể góp phần vào hiện tượng này Hình dạng đỉnh không đối xứng hoặc có đuôi thường xuất phát từ thể tích hoặc nồng độ mẫu quá cao Giải pháp đơn giản cho vấn đề này là bơm thể tích mẫu nhỏ hơn hoặc pha loãng mẫu trước khi phân tích.

Hình dạng pic kém thường xuất phát từ nồng độ đệm quá thấp, việc làm việc với hệ thống thiếu bộ đệm cần thiết và việc sử dụng hệ thống pha không thuận lợi.

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

2.1 Nguyên tắc của phương pháp PCR (K Kadri, 2019)

PCR là một phương pháp hiệu quả để nhân bản một lượng lớn chuỗi DNA từ mẫu DNA ban đầu Khuôn mẫu DNA có thể là bộ gen, DNA được tạo ra từ quá trình phiên mã ngược từ RNA, hoặc DNA ty thể.

Kỹ thuật này bao gồm ba giai đoạn chính: biến tính, lai ghép với mồi và kéo dài Mỗi sản phẩm của các bước tổng hợp sẽ đóng vai trò là khuôn mẫu cho các giai đoạn tiếp theo, giúp đạt được sự khuếch đại theo hàm mũ.

Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) diễn ra trong một hỗn hợp phản ứng bao gồm DNA khuôn mẫu, Taq polymerase, các đoạn mồi và bốn loại deoxyribonucleoside triphosphat (dNTPs) với nồng độ dư thừa trong dung dịch đệm.

Các ống chứa mẫu phải trải qua nhiều chu kỳ nhiệt độ trong bộ tuần hoàn nhiệt, thiết bị này có khả năng điều chỉnh nhiệt độ từ 0 đến 100°C một cách nhanh chóng và chính xác nhờ hiệu ứng Peltier.

Thiết bị này cho phép lập trình thời gian và sự liên tiếp của các chu kỳ nhiệt độ trong quy trình PCR Mỗi chu kỳ bao gồm ba khoảng thời gian kéo dài vài chục giây, và quy trình PCR được chia thành ba giai đoạn chính.

2.1.1 Giai đoạn biến tính Đây là giai đoạn phân tách của hai sợi DNA, thu được bằng cách tăng nhiệt độ.Thời kỳ đầu tiên thực hiện ở nhiệt độ 94°C, gọi là nhiệt độ biến tính Ở nhiệt độ này,DNA mẫu, đóng vai trò là chất nền trong quá trình sao chép bị biến tính.

Hình 2.1 Giai đoạn biến tính DNA mẫu

Các liên kết hydro không thể duy trì ở nhiệt độ cao hơn 80°C do đó DNA sợi kép bị tách thành 2 DNA sợi đơn (single-stranded DNA).

Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ từ 40 đến 70°C, đây được gọi là nhiệt độ lai mồi

Giảm nhiệt độ cho phép các liên kết hydro mới được hình thành và do đó các sợi đơn được bổ sung để lai hóa

Các đoạn mồi ngắn và trình tự sợi đơn bổ sung cho các vùng bên hông của DNA được khuếch đại giúp quá trình lai ghép trở nên dễ dàng hơn so với DNA mẫu sợi dài Nhiệt độ lai hoá cao sẽ tăng cường tính chọn lọc và đặc hiệu của quá trình này.

Giai đoạn thứ ba của quá trình PCR diễn ra ở nhiệt độ 72°C, được gọi là nhiệt độ kéo dài, nơi Taq polymerase kết hợp với DNA sợi đơn đã được mồi để tổng hợp các sợi bổ sung Tại nhiệt độ này, enzyme xúc tác quá trình sao chép bằng cách sử dụng deoxyribonucleoside triphosphat có trong hỗn hợp phản ứng.

Do đó, các vùng của DNA khuôn mẫu ở cuối của mồi được tổng hợp một cách chọn lọc.

Hình 2.3 Giai đoạn kéo dài

Trong chu kỳ tiếp theo, các đoạn gen được tổng hợp từ chu kỳ trước sẽ trở thành khuôn mẫu Sau một vài chu kỳ, đoạn gen ưu thế sẽ tương ứng với trình tự DNA nằm giữa các vùng mà mồi lai với nhau.

Để tổng hợp khoảng 0,1 μg DNA có thể phân tích, cần thực hiện từ 20 đến 40 chu kỳ Theo lý thuyết, mỗi chu kỳ sẽ làm tăng gấp đôi lượng DNA so với chu kỳ trước đó.

PCR là một phương pháp hiệu quả để khuếch đại các trình tự DNA có kích thước nhỏ hơn 6 kilobase Quá trình phản ứng PCR diễn ra rất nhanh chóng, chỉ mất từ 2 đến 3 giờ cho 30 chu kỳ.

Hình 2.4 Sơ đồ tổng hợp các bước của phương pháp PCR

2.2 Thành phần chủ yếu của phương pháp PCR (Dey P., 2018)

Các đoạn mồi là những đoạn nhỏ của chuỗi DNA nhân tạo, đây là những đoạn bổ sung ở đầu 3′ của mỗi sợi DNA đích

Các đoạn mồi thường bao gồm 20–30 nucleotide.

Mồi là các DNA sợi đơn, và việc lai ghép trên các trình tự gần kề với trình tự mục tiêu sẽ cho phép sao chép có chọn lọc của nó.

Taq polymerase là enzyme DNA polymerase chuyên dụng cho việc tổng hợp DNA mới Enzyme này gắn vào đầu mồi và liên tục thêm các nucleotide mới vào sợi DNA ở đầu 3′, tạo ra bản sao chính xác của DNA đích.

Nhiệt độ cao lên đến 94°C là cần thiết để tách DNA sợi kép, nhưng tại nhiệt độ này, DNA polymerase thông thường sẽ bị phá vỡ Đặc biệt, Taq polymerase có khả năng hoạt động hiệu quả ở nhiệt độ cao, giúp duy trì quá trình sao chép DNA.

Taq DNA polymerase này được chiết xuất từ vi khuẩn Thermus aquaticus. Những vi khuẩn này sống trong suối nước nóng và có thể tồn tại ở đó.

Deoxynucleotide triphosphat (dNTP), bao gồm dATP, dCTP, dGTP và dTTP, là nguyên liệu thiết yếu để tổng hợp các sợi DNA mới Enzyme Taq polymerase sử dụng các dNTP này từ dung dịch làm việc và kết hợp chúng vào đầu mồi để kéo dài chuỗi DNA.

DNA cần khuếch đại được chiết xuất từ mẫu.

Dung dịch đệm tạo môi trường hóa học tối ưu cho phản ứng xảy ra.

Magie clorua hoạt động như một đồng yếu tố của enzym Taq polymerase.

2.3 Phát hiện và phân tích sản phẩm PCR (Dey P., 2018)

ENZYMEE-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)

ELISA là một phương pháp dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể, thể hiện sự tương tác hóa học giữa các kháng thể do tế bào B của bạch cầu sản xuất và kháng nguyên Phản ứng miễn dịch này rất quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể khỏi các tác nhân xâm nhập như mầm bệnh và độc tố.

ELISA là một phương pháp phân tích định lượng và định tính có độ nhạy cao, cho phép phát hiện các kháng nguyên như protein, peptide, axit nucleic, hormone, thuốc diệt cỏ và các chất chuyển hóa thứ cấp của thực vật Phương pháp này sử dụng kháng nguyên hoặc kháng thể được đánh dấu bằng enzym trong xét nghiệm miễn dịch enzym, với alkaline phosphatase (ALP), horseradish peroxidase (HRP) và β-galactosidase là những enzym phổ biến nhất được sử dụng.

Kháng nguyên trong pha lỏng được cố định trên pha rắn, như tấm microtiter làm từ polystyrene, polyvinyl clorua và polypropylene Sau đó, kháng nguyên sẽ phản ứng với kháng thể cụ thể, và kháng thể này được phát hiện thông qua kháng thể thứ cấp được đánh dấu enzym.

Hình 3.1 Nguyên lý hoạt động của phương pháp ELISA

Màu sắc được tạo bằng cách sử dụng chất nền sinh màu tương ứng với sự hiện diện của kháng nguyên.

Các phản ứng enzym - cơ chất thường diễn ra trong khoảng thời gian 30–60 phút và sẽ ngừng lại khi bổ sung dung dịch thích hợp như natri hydroxit, axit clohydric, axit sulfuric, natri cacbonat hoặc natri azit cho từng phản ứng cụ thể Cuối cùng, các sản phẩm có màu hoặc huỳnh quang được phát hiện bằng đầu đọc tấm microtiter.

3.2 Các loại ELISA (Sakamoto S và cộng sự, 2017)

Năm 1971, Engvall và Perlmann và Van Weemen và Schuurs là những người đầu tiên phát triển ELISA trực tiếp, là kiểu cơ sở cho các loại ELISA khác

Hình 3.2 ELISA trực tiếp để phát hiện kháng nguyên (a) và kháng thể (b)

Để thực hiện quy trình, trước tiên cần gắn kháng nguyên hoặc kháng thể vào pha rắn Sau đó, ủ hỗn hợp với kháng thể hoặc kháng nguyên được đánh dấu enzym Tiếp theo, rửa sạch để loại bỏ các kháng thể hoặc kháng nguyên đánh dấu enzym chưa liên kết Cuối cùng, tạo màu bằng chất nền để hoàn tất quá trình.

Kháng nguyên hoặc kháng thể được cố định trên bề mặt tấm microtiter, sau đó bề mặt được chặn bằng các protein như albumin, gelatin, casein và sữa gầy để ngăn chặn sự hấp phụ không đặc hiệu Tiếp theo, kháng thể hoặc kháng nguyên được đánh dấu enzym sẽ phản ứng với mục tiêu cố định, dẫn đến việc tạo màu với chất nền thích hợp Khi số lượng mục tiêu tăng lên, tín hiệu cũng sẽ gia tăng.

ELISA trực tiếp thích hợp cho việc phân tích định tính các đại phân tử.

Vào năm 1973, Belanger đã phát triển phương pháp ELISA cạnh tranh để phát hiện α-fetoprotein ở chuột, đánh dấu bước tiến quan trọng cho sự phát triển của ELISA gián tiếp và ELISA sandwich Phương pháp ELISA cạnh tranh hoạt động dựa trên cơ chế phản ứng cạnh tranh giữa mục tiêu trong mẫu (kháng nguyên hoặc kháng thể) và mục tiêu được đánh dấu enzym, nhằm xác định sự tương tác với kháng thể hoặc kháng nguyên cố định.

Hình 3.3 ELISA cạnh tranh để phát hiện kháng nguyên (a) và kháng thể (b)

Quy trình ELISA bao gồm các bước: gắn kháng nguyên/kháng thể vào pha rắn, ủ với kháng thể/kháng nguyên đánh dấu enzym, rửa sạch kháng thể/kháng nguyên chưa liên kết, và tạo màu với chất nền Trong phương pháp ELISA cạnh tranh, kháng nguyên đánh dấu enzym cạnh tranh với các kháng nguyên đích để gắn vào kháng thể cố định Khi lượng kháng nguyên trong mẫu tăng lên, lượng kháng nguyên đánh dấu enzym gắn vào kháng thể sẽ giảm, dẫn đến tín hiệu giảm Phương pháp này chủ yếu phù hợp để đo các đại phân tử vì cần enzym đánh dấu để xác định kháng nguyên.

Khi kháng nguyên là hợp chất có trọng lượng phân tử thấp như hapten, các liên hợp hapten-enzym không được nhận diện bởi kháng thể cố định, dẫn đến phân tích không thành công Để phát hiện kháng thể, kháng nguyên cần được cố định, và sự cạnh tranh giữa kháng thể trong mẫu và kháng thể đánh dấu enzym sẽ được quan sát Trong trường hợp này, cả đại phân tử lẫn hapten đều có thể được phát hiện khi hapten tiếp xúc với bề mặt của tấm microtiter.

Các mục tiêu phát hiện (kháng nguyên hoặc kháng thể) có thể thay đổi tùy thuộc vào đối thủ cạnh tranh Khi sử dụng kháng nguyên tự do làm đối thủ cạnh tranh thay vì kháng thể không có nhãn, phản ứng cạnh tranh giữa kháng nguyên tự do và kháng nguyên cố định với kháng thể đánh dấu enzym sẽ được quan sát, cho phép phát hiện kháng nguyên tự do trong mẫu Ngược lại, khi sử dụng kháng thể tự do thay vì kháng nguyên không được gắn nhãn, cũng có thể quan sát được sự cạnh tranh này.

Hệ thống ELISA gián tiếp đã được phát triển trên cơ sở ELISA trực tiếp để đánh giá sự hiện diện của kháng thể trong kháng huyết thanh.

Hình 3.4 ELISA gián tiếp để phân tích kháng thể

Quy trình bao gồm các bước sau: đầu tiên, gắn kháng nguyên vào pha rắn; sau đó, ủ với kháng thể chính; tiếp theo, rửa sạch kháng thể sơ cấp không liên kết; tiếp tục ủ với kháng thể thứ cấp được đánh dấu enzym; và cuối cùng, tạo màu bằng chất nền.

Quá trình liên kết giữa hai kháng thể chính và kháng thể thứ cấp đánh dấu enzym là bước quan trọng trong hệ thống này Điều này có nghĩa là kháng nguyên đích được phát hiện một cách gián tiếp thông qua kháng thể thứ cấp, được đánh dấu bằng enzym, thường được gọi là ELISA gián tiếp.

Kháng nguyên được cố định trên bề mặt tấm microtiter, nơi mà các protein ngăn chặn đã được sử dụng để bảo vệ bề mặt Sau đó, kháng thể chính từ kháng huyết thanh sẽ liên kết với kháng nguyên cố định, cho phép phản ứng với kháng thể thứ cấp được đánh dấu enzym Quá trình này dẫn đến sự phát triển của màu sắc, với tín hiệu tăng lên khi lượng kháng nguyên đích không di động gia tăng.

ELISA gián tiếp là phương pháp lý tưởng để đo lường các đại phân tử, đặc biệt là khi sử dụng kháng huyết thanh làm kháng thể chính Phương pháp này cho phép đánh giá sự hiện diện của các kháng thể liên quan đến bệnh trong mẫu kháng huyết thanh.

3.2.4 ELISA cạnh tranh gián tiếp

ELISA cạnh tranh gián tiếp (icELISA) liên quan đến sự kết hợp của ELISA gián tiếp và ELISA cạnh tranh.

Hình 3.5 ELISA cạnh tranh gián tiếp để phát hiện kháng nguyên

Quy trình bao gồm các bước sau: đầu tiên, gắn kháng nguyên vào pha rắn; tiếp theo, ủ kháng nguyên đích tự do với kháng thể chính; sau đó, rửa sạch để loại bỏ kháng nguyên đích tự do không liên kết và kháng thể chính; tiếp theo, ủ với kháng thể thứ cấp được đánh dấu enzym; cuối cùng, tạo màu với chất nền.

PULSED FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE)

4.1 Nguyên tắc (Nassonova E S., 2008) Điện di trên gel trường xung (PFGE) là một kỹ thuật cho phép tách các phân tử DNA trong gel agarose bằng cách sử dụng hai điện trường xen kẽ, với các vectơ hướng tới nhau ở góc tù.

PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis) là kỹ thuật phân đoạn các phân tử DNA lớn, với kích thước từ 10 kb đến 10 Mb, bao gồm DNA nhiễm sắc thể của sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân thực bậc thấp Kỹ thuật này cho phép điều khiển DNA của toàn bộ nhiễm sắc thể hoặc các đoạn lớn của chúng, đặc biệt là đối với sinh vật bậc cao Chính vì vậy, PFGE được xem là một công cụ quan trọng trong nghiên cứu hệ gen hiện đại.

Hình 4.1 Sơ đồ thể hiện cơ chế phân đoạn DNA trong quá trình điện di trên gel trường xung

Khi chuyển đổi điện trường, các phân tử DNA bắt đầu di chuyển ngược lại trong gel, với các đuôi của chúng dẫn đầu Mỗi phân tử di chuyển theo tỷ lệ với kích thước của nó, dẫn đến việc các phân tử dài hơn nằm sau các phân tử ngắn hơn Khi chuyển sang trường mới, sự chậm lại của các phân tử dài hơn trở nên rõ rệt hơn Các vectơ cường độ điện trường E1, E2 thể hiện sự khác biệt giữa các phân tử DNA dài và ngắn, với các mũi tên chỉ hướng di chuyển và vị trí của các đầu cuối Các đường đứt nét minh họa dấu vết di chuyển của các phân tử trong gel.

4.2 Thiết bị và quy trình thực hiện (Nassonova E S., 2008) Điện trường được chuyển đổi trong những khoảng thời gian nhất định ở một góc 90°

Gel được sử dụng trong buồng điện di ngang, nơi một điện trường đồng nhất được tạo ra bởi hai hàng điểm điện cực Ngoài ra, còn có một điện trường không đồng nhất, hình thành từ nhiều điểm điện cực âm và một điểm điện cực dương Hệ thống này được biết đến với tên gọi “điện di gradient trường xung” (PFGE).

Hình 4.2 Giản đồ thể hiện hình dạng điện cực trong các dụng cụ thường dùng cho điện di gel trường xung

Các tác giả xem gradient điện thế là yếu tố quyết định cho việc tách rời các phân tử DNA trong trường xung Họ đã áp dụng các cấu hình điện cực cuối cùng để tạo ra một trường không đồng nhất Trong hệ thống này, góc giữa các vectơ cường độ trường biến đổi ở các khu vực gel khác nhau, dao động từ 110° đến 150°.

Các phân tử có kích thước tương đương di chuyển với tốc độ khác nhau trong gel, phụ thuộc vào vị trí ban đầu của chúng Điều này gây khó khăn trong việc so sánh sự di động điện di của DNA trên các làn đường viền, dẫn đến việc không thể ước tính chính xác kích thước của chúng.

4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ chính xác của phương pháp (Nassonova E S.,

4.3.1 Thời gian xung (thời gian chuyển đổi, khoảng thời gian chuyển đổi)

Thời gian xung là yếu tố quyết định trong quá trình chuyển hướng của trường điện, đóng vai trò quan trọng trong việc phân tách ADN Các thí nghiệm đầu tiên đã chỉ ra rằng thời gian xung ảnh hưởng lớn đến hiệu quả phân đoạn phân tử trong điện trường xung.

Kích thước của các phân tử phân đoạn càng lớn thì việc chuyển đổi điện trường càng ít

Để phân đoạn DNA hiệu quả trong một phạm vi kích thước rộng, cần xác định chế độ tăng tuần tự của thời gian xung, vì chỉ các phân tử có kích thước cụ thể mới xuất hiện trong điều kiện tối ưu trong khoảng thời gian nhất định.

Hình 4.3 Ví dụ về phân đoạn và xác định kích thước của DNA nhiễm sắc thể bằng điện di trên gel trường xung với đoạn dốc thời gian xung

Sự thay đổi thời gian xung trong quá trình điện di được gọi là "tăng dần" Tham số này có thể được điều chỉnh trong suốt quá trình chạy, cho phép tăng liên tục hoặc không liên tục trên một dải giá trị rời rạc Quá trình gia tăng liên tục thời gian xung từ giá trị nhỏ nhất đến lớn nhất trong một khoảng thời gian xác định được gọi là tăng dần thời gian xung.

"nội suy" Một biến thể thay thế, thời gian xung tăng lên từng bước, được gọi là

Sự phân giải phân tử trong gel được xác định bởi khoảng cách và độ sắc nét của các dải Khu vực trong gel nơi DNA được phân tách hiệu quả được gọi là "vùng phân giải" Trong vùng này, mối quan hệ giữa tốc độ di chuyển của DNA và kích thước phân tử là tuyến tính, cho phép ước tính chính xác kích thước của các phân tử DNA.

4.3.2 Cường độ trường Độ phân giải là hàm của cả thời gian xung và cường độ điện trường Nhìn chung,cường độ trường càng cao thì tốc độ di chuyển phân tử càng cao Tuy nhiên, kích thước phân tử càng cao thì sự phụ thuộc này càng lệch khỏi hàm tuyến tính Để tách các phân tử nhỏ hơn 1 Mb, cường độ trường áp dụng là 6 –10 V/cm. Cường độ trường càng thấp, độ phân giải càng cao; tuy nhiên, phạm vi kích thước của các phân tử được phân tách hẹp hơn

Cường độ trường điện quá cao (trên 10 V/cm) gây ra sự phân tách phân tử yếu và tạo ra hiện tượng "vết bẩn", với các vùng nhuộm DNA đồng nhất và các dải đơn không thể nhận diện bằng mắt thường Đối với các phân tử lớn hơn 1 Mb, cường độ trường cao dẫn đến "hiệu ứng bẫy", làm cho phân tử bị cố định vĩnh viễn trong gel do những thay đổi không thể đảo ngược trong cấu trúc của chúng Do đó, các phân tử này nên được phân đoạn ở cường độ trường thấp (1–3 V/cm) để đạt hiệu quả tốt nhất.

Thời gian xung và cường độ trường là các yếu tố có liên quan lẫn nhau Độ phân giải PFGE được xác định bằng “hàm Window” sau:

Trong đó E là cường độ điện trường và Tp là thời gian xung

Giá trị hàm W càng cao, kích thước phân tử DNA càng lớn, giúp phân tách hiệu quả hơn Sự phân tách các phân tử DNA có cùng kích thước có thể đạt được bằng cách điều chỉnh thời gian xung khác nhau, miễn là cường độ trường được thay đổi để giữ giá trị hàm W không đổi.

Trong các thiết bị PFGE, một số thiết bị có tham số góc cố định, trong khi các thiết bị khác có thể điều chỉnh góc từ 90 đến 180° Nghiên cứu cho thấy sự thay đổi góc không ảnh hưởng đáng kể đến sự di chuyển của các phân tử nhỏ hơn 1 Mb, nhưng đối với các phân tử lớn hơn, độ linh động tăng khi góc giảm, mặc dù độ phân giải dải trong gel lại giảm Theo kinh nghiệm, giá trị góc tối ưu cho sự phân tách tốt nhất là trên 110°, và hầu hết các thiết bị PFGE thương mại hiện nay sử dụng góc cố định là 120°.

4.3.4 Nồng độ agarose trong gel

Nồng độ agarose trong gel có tác động ít hơn đến tính di động của các phân tử DNA khi điện di trong trường xung so với trong trường không đổi.

SẮC KÝ KHÍ (GC)

Sự phân tách diễn ra khi các thành phần riêng lẻ chậm lại khi di chuyển qua một cột dài, được hỗ trợ bởi khí mang như heli hoặc nitơ.

Cột bao gồm một ống thép hoặc thủy tinh chứa đầy vật liệu đóng gói trơ như thủy tinh hoặc hạt gốm.

Hình 5.1 Sơ đồ của hệ thống sắc ký khí

Trong sắc ký khí-lỏng (GLC), bề mặt chất lỏng dễ bay hơi được phủ lên chất rắn, tạo ra diện tích tiếp xúc lớn với khí Ngược lại, sắc ký khí-rắn (GSC) không sử dụng lớp phủ chất lỏng, nhưng phương pháp này ít phổ biến hơn so với GLC.

Mẫu được bơm vào dòng khí mang, và khi di chuyển qua cột, các phân tử trong mẫu phân bố giữa chất khí và chất lỏng Các phân tử liên tục chuyển động giữa hai pha này ở trạng thái cân bằng động Khi một phân tử ở pha khí, nó sẽ di chuyển dọc theo cột, trong khi ở pha lỏng, nó sẽ đứng yên Chất càng dễ bay hơi, thời gian ở pha khí càng nhiều, dẫn đến việc nó ra khỏi cột sớm hơn Nhờ vậy, mỗi chất sẽ được tách ra trong cột và phân tách theo thời gian ở đầu ra.

Thời gian lưu (Rt) là khoảng thời gian từ khi tiêm đến khi đạt đỉnh và đặc trưng cho từng chất trong các điều kiện nhất định Thời gian này phụ thuộc vào độ bay hơi của chất, nhiệt độ của cột, cũng như chiều dài và đường kính của nó Nhiều chất có thời gian lưu giữ lâu ở nhiệt độ phòng, gây bất tiện, nhưng vấn đề này có thể được khắc phục bằng cách nung cột trong lò.

Sau khi tách các thành phần trong cột, việc phát hiện và đo lường chúng là rất cần thiết Hai loại detector phổ biến được sử dụng trong quá trình này là detector dẫn nhiệt và detector ion hóa ngọn lửa.

Máy dò độ dẫn nhiệt (TCD) hoạt động dựa trên sự thay đổi độ dẫn nhiệt của khí khi rời khỏi cột Khí mang helium tinh khiết đi qua dây tóc vonfram-helium nóng, dẫn đến làm mát do độ dẫn nhiệt cao của helium Khi có chất hóa học xuất hiện cùng khí mang, quá trình làm mát giảm, làm tăng nhiệt độ của dây tóc Sự tăng nhiệt độ này dẫn đến tăng điện trở, cho phép đo đạc và ghi lại Trong khi đó, phát hiện ion hóa ngọn lửa (FID) thường được sử dụng trong ứng dụng thực phẩm do độ nhạy cao với các hợp chất hữu cơ, nhạy hơn gấp một nghìn lần so với TCD Khí thoát ra từ cột được đốt cháy bằng hỗn hợp hydro và không khí, tạo ra các ion dẫn đến dòng điện có thể khuếch đại và ghi lại Mặc dù số lượng ion tạo ra rất nhỏ, tỷ lệ này luôn không đổi, cho phép tín hiệu ghi lại tỷ lệ với lượng hóa chất có mặt trong mẫu.

5.2 Chọn điều kiện chạy sắc ký (Al-Bukhaiti W Q., 2017)

Cột là phần quan trọng nhất trong máy sắc ký, đóng vai trò khởi đầu và trung tâm của quá trình phân tách Việc lựa chọn cột phù hợp sẽ giúp đạt được sự phân tách sắc ký tốt, từ đó đảm bảo phân tích chính xác và đáng tin cậy.

Việc sử dụng cột không đúng cách có thể gây ra sự phân tách khó hiểu và không đầy đủ, dẫn đến kết quả không hợp lệ hoặc khó diễn giải.

Có hơn 10,000 hợp chất có thể phân tích bằng phương pháp sắc ký khí (GC) và hơn 400 loại cột mao quản GC khác nhau Việc lựa chọn cột và thiết bị hỗ trợ ban đầu ảnh hưởng lớn đến khả năng và kết quả tối ưu hóa phân tách Điều chỉnh các thông số của cột như pha tĩnh, đường kính trong, chiều dài và độ dày màng giúp máy sắc ký kiểm soát hiệu quả độ phân giải và tốc độ phân tích.

Trong sắc ký khí, thứ tự rửa giải của chất phân tích phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm áp suất hơi tiềm ẩn, khả năng hòa tan trong pha tĩnh và xu hướng tương tác phân tử trong pha tĩnh Những yếu tố này biến đổi theo nhiệt độ, và sự phối hợp của chúng quyết định sự phân bố cân bằng của các phân tử chất tan giữa pha động và pha tĩnh.

Việc xác định vận tốc tuyến tính trung bình tốt nhất khá dễ dàng và chỉ liên quan đến một lượng nhỏ thử và sai

Hydro cung cấp độ phân giải tốt nhất trong khoảng thời gian ngắn nhất

Helium cung cấp độ phân giải tương tự với thời gian phân tích kéo dài hơn Khi sử dụng heli làm khí mang, nên bắt đầu với vận tốc tuyến tính trung bình khoảng 30 cm/giây.

Nitơ không được khuyến khích sử dụng với cột mao quản do thời gian phân tích quá dài

Khi chọn khí làm pha động trong sắc ký khí, cần xem xét các yếu tố quan trọng như tính trơ, độ khô, mức độ oxy tự do, độ an toàn, chi phí và tính sẵn có của khí.

5.2.3 Tối ưu hóa chương trình nhiệt độ lò cột

Cột trong tủ sấy và nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong hiệu quả tách sắc ký, ảnh hưởng lớn đến quá trình kiểm soát GC.

Trong nhiều tình huống, đẳng nhiệt không phải là phương pháp tối ưu để tách mẫu, và trong những trường hợp đó, chương trình nhiệt độ là lựa chọn thay thế Hầu hết các chương trình nhiệt độ trong sắc ký khí (GC) bao gồm một nhiệt độ ban đầu, một đoạn đường nối với độ tăng nhiệt mỗi phút, và nhiệt độ cuối cùng.

Sử dụng chương trình nhiệt độ tuyến tính làm điểm khởi đầu khi không có thông tin phân tích trước đó Bước đầu tiên trong phát triển chương trình là thử nghiệm với một chương trình nhiệt độ tuyến tính đơn giản Để cải thiện độ phân giải của các pic rửa giải sớm, có thể giảm nhiệt độ ban đầu hoặc tăng thời gian giữ Giảm nhiệt độ ban đầu thường mang lại cải thiện độ phân giải lớn nhất, mặc dù thời gian phân tích sẽ tăng Độ phân giải của các peak rửa giải giữa sắc ký đồ có thể bị ảnh hưởng bởi sự thay đổi tốc độ dốc Nếu độ phân giải đỉnh quá mức, có thể tăng tốc độ đường nối để giảm độ phân giải và thời gian phân tích Ngược lại, nếu không đủ độ phân giải, cần giảm tốc độ đường nối và tăng thời gian phân tích Thông thường, độ phân giải tốt hơn của các đỉnh rửa giải sau này xảy ra khi giảm tốc độ dốc.