TỔNG QUAN
Tổng quan về họ Sargassaceae
Theo hệ thống phân loại thực vật, họ Sargassaceae có vị trí phân loại như sau:
Phân giới thực vật bậc thấp
Bộ rong Đuôi ngựa: Fucales
Họ Rong mơ: Sargassaceae Theo hệ thống phân loại của Agardh, J.G (1889), họ Rong mơ Sargassaceae gồm có 3 chi:
Chi Hormophysa Kuetzing 1843 (Rong Khế)
Chi Turbinaria Lamouroux 1828 (Rong Cùi bắp)
Chi Sargassum Agardh, C 1821 (Rong Mơ) gồm 5 phân chi:
Phyllotricha J Ag, Schizophycus J Ag, Bactrophycus J Ag, Arthrophycus J Ag, Eusargassum J Ag.[3]
1.1.2 Phân bố và thu hái
Họ Rong mơ (Sargassaceae), thuộc ngành Rong Nâu (Phaeophyceae), bao gồm các loài chủ yếu phân bố ở vùng biển nhiệt đới và có kích thước lớn Đây là nhóm rong biển có sản lượng cao nhất trong số các giống loài rong biển tại Việt Nam.
Họ Rong mơ chủ yếu phân bố ở các quốc gia như Trung Quốc, Nhật Bản, Australia và Philippines Tại Việt Nam, họ Rong mơ thường tập trung nhiều ở các đảo và ven biển của các tỉnh như Quảng Ninh, Hải Phòng, Thanh Hóa, Nghệ Tĩnh, Bình Trị Thiên, Nghĩa Bình, Phú Khánh, Thuận Hải, Đồng Nai và Kiên Giang.
Hình 1.1: Nghiên cứu hiện trạng rong biển tại 19 đảo: Họ Sargassaceae có số loài nhiều nhất (33 loài) trong tổng số 62 họ đã xác định [5]
Rong biển thường trưởng thành và phóng thích giao tử trong các tháng 3, 4 và 5, với sản lượng cao nhất vào tháng 3 Tuy nhiên, trong thời gian này, rong chưa hoàn toàn trưởng thành và hàm lượng acid alginis còn thấp, do đó việc khai thác nên được thực hiện vào tháng 4 và các tháng sau để bảo tồn nòi giống cho mùa sau.
1.1.3 Đặc điểm hình thái các đại diện của họ Sargassaceae
Các đơn vị phân loại trong họ Sargassaceae sở hữu những đặc điểm hình thái độc đáo, tương tự như thực vật bậc cao Các cơ quan bám có hình dạng như rễ và phát triển phân nhánh phong phú, đặc biệt ở các chi Hormophysa, Turbinaria và một số loài thuộc chi Sargassum.
Lá là cơ quan dinh dưỡng quan trọng, có hình dạng và kích thước đa dạng, thường có thể phân nhánh Mép lá có thể có răng cưa to, nhọn hoặc cùn, thậm chí có thể trở nên trơn nhẵn Một đặc điểm nổi bật của rong mơ là sự hiện diện của phao hay túi khí, có mối quan hệ chặt chẽ với lá Phao này thể hiện nhiều tính chất cho thấy nó có nguồn gốc từ lá và có xu hướng chuyển hóa để tạo thành dạng riêng biệt.
Cơ quan sinh sản của cây được gọi là đế, với hình dạng khác nhau giữa cây đực và cây cái Đế của cây đực thường có hình trụ, trong khi đế của cây cái có thể phẳng hoặc có ba cạnh, thường có răng hoặc gai Chúng có thể mọc đơn giản hoặc thành chùm dày với sự phân nhánh phức tạp.
Hình 1.2: Một số cơ quan đặc trưng của các loài thuộc họ Sargassaceae[3]
Họ Rong mơ Sargassaceae có thành phần hóa học rất phong phú và đa dạng với các hợp chất mang giá trị dinh dưỡng cao
Nghiên cứu cho thấy thành phần của rong biển chủ yếu bao gồm nước (chiếm 80-90%), protein (5-20,5% trọng lượng khô), 17 loại acid amin (được xác định qua phương pháp sắc ký lỏng cao áp), lipid (0,2-0,6%), cùng với các sắc tố, khoáng chất, hợp chất chống oxy hóa và các nguyên tố đa lượng như K, Na, Mg, S.
…) và đặc biệt là các nguyên tố vi lượng (hàm lượng các nguyên tố Fe, Mn,
Cu và Zn trong Rong Mơ rất cao mà không phải loài thực vật nào trên cạn cũng đạt được).[7]
Rong Mơ chứa các sắc tố như diệp lục tố (Chlorophyn), diệp hoàng tố (Xantophyl), sắc tố màu nâu (Fucoxanthin) và sắc tố đỏ (Caroten) Tùy thuộc vào tỷ lệ các sắc tố này, rong có thể có màu từ nâu, vàng nâu, nâu đậm đến vàng lục Nhìn chung, các sắc tố trong họ Rong Mơ có độ bền khá cao.
Thành phần hóa học quan trọng của Rong nâu nói chung và họ Rong mơ (Sargassaceae) nói riêng là các glucid, chúng được chia thành 2 nhóm: monosaccharide và polysaccharide.
Nhóm monosaccharide bao gồm các loại đường đơn như mannitol, fucose, galactose, manose, và xylose, trong đó mannitol là quan trọng nhất Hàm lượng mannitol trong rong khô dao động từ 14% đến 25% tùy thuộc vào điều kiện địa lý, thường cao hơn vào mùa hè và có xu hướng tăng dần theo thời gian sinh trưởng của rong.
Polysaccharide trong họ Rong mơ chiếm một tỷ lệ lớn, bao gồm acid alginic, laminaran, fucoidan và dẫn xuất của chúng. a) Acid alginic:
Acit alginic là polysaccharide chứa cacboxyl được tạo thành bằng cách tham gia axit β-D-mannuronic và axit α-L-guluronic thông qua liên kết β - (1
Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của Alginate
Hàm lượng acid alginic trong rong mơ dao động từ 2-4% ở dạng tươi và 13-15% ở dạng khô Các thuộc tính lý, hóa sinh học của alginate thay đổi tùy thuộc vào loài rong, giai đoạn trưởng thành, mùa vụ và môi trường sống.
Fucoidan là một polysaccharide sulfat tự nhiên hòa tan trong nước, với cấu trúc cốt lõi chủ yếu bao gồm các nhóm fucose và acid sulfuric Nó được liên kết bởi L-fucose thông qua liên kết glycosidic α-(1 → 3) và thể hiện hoạt tính sinh học mạnh mẽ Tỷ lệ fucose trong fucoidan dao động từ 18,6% đến 60%, trong khi tỷ lệ sulfate nằm trong khoảng từ 17,7% đến 39,2%.
Hình 1.4: Cấu trúc hóa học của Fucoidan c) Laminaran:
Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của Laminarin
Laminarin là một polysaccharide lưu trữ β-glucan có trọng lượng phân tử thấp, được tìm thấy trong rong nâu Chất này có thể được biến đổi hóa học để nâng cao hoạt tính sinh học, và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như điều trị ung thư, phân phối thuốc và gen, kỹ thuật mô, cũng như trong các sản phẩm chống oxy hóa và chống viêm.
Laminarin có hàm lượng từ 10 – 15% trọng lượng rong khô tùy thuộc vào loại rong, vị trí địa lý và môi trường sinh sống của họ Rong mơ [7]
1.1.4.3 Hợp chất chống oxy hóa:
Polyphenol là hợp chất chuyển hóa thứ cấp có trong họ Rong mơ, bao gồm các nhóm OH gắn trực tiếp vào nhân benzen Các hợp chất này bao gồm flavonoid, lignin, tannin và phlorotannin, và chúng mang lại nhiều hoạt tính khác nhau.
Hình 1.6: Cấu trúc hóa học của Phlorotannin
Phlorotannins là nhóm tanin độc đáo chỉ có ở rong biển, với hàm lượng từ 1 đến 15% trọng lượng khô của rong biển Chúng là các hợp chất ưa nước và được biết đến với khả năng chống oxy hóa trong họ Sargassaceae.
1.1.4.4 Protein, chất khoáng và các hợp chất khác
Protein trong họ Rong mơ (Sargassaceae) mặc dù không cao nhưng có chất lượng hoàn hảo, tương đương với các protein thực vật thông thường Các loài rong mơ có thể được sử dụng làm thực phẩm Đặc biệt, protein của họ Sargassaceae thường kết hợp với iod, tạo ra các hợp chất hữu cơ như MonoIodinzodizin và DiIodinzodizin, có giá trị trong y học và được sử dụng trong phòng chống và chữa bệnh bướu cổ (Basedow).
Tổng quan về loài Rong Khế
Việt Nam sở hữu hơn 3.260 km bờ biển với nguồn tài nguyên rong biển phong phú Trong số đó, Rong Nâu là loại rong biển tự nhiên có giá trị kinh tế lớn nhất, với hai chi rong có trữ lượng đáng kể là Sargassum (Rong Mơ) và Hormophysa (Rong Khế).
Hormophysa cuneiformis hay Hormophysa articulata (tên Tiếng Việt còn được gọi là Rong Khế) là loài thực vật thuộc chi Hormophysa họ Rong
Mơ Sargassaceae, ngành Rong Nâu Loài Rong Khế này được phát hiện trong bộ sưu tập Herbarium Pacificum của Bảo tàng Bishop.[23] Tại Việt Nam, có
Mẫu Hormophysa cuneiformis, được thu hái từ lâu, hiện vẫn được bảo quản và sử dụng tại Bảo tàng Hải dương học Tại đây, có tổng cộng 651 mẫu của 209 loài rong biển khác nhau đang được trưng bày.
Hình 1.7: Hình ảnh mẫu vật Hormophysa cuneiformis
Tản rong Hormophysa cuneiformis có chiều cao từ 20 – 50 cm, với màu sắc nâu vàng hoặc nâu sẫm, bám chắc vào vật thể bằng rễ giả hình trụ phân nhánh Cây có 2 – 3 nhánh chính hình trụ, đường kính từ 1 – 2 mm, phân thành nhiều nhánh sắp xếp xen kẽ theo mọi hướng Phiến lá dài từ 0,5 - 3 cm, rộng tới 4 mm, với mép có răng cưa lớn Phao hình thành chuỗi ở giữa lá và nhánh, mọc theo 2 hoặc thường 3 hướng khác nhau, có hình thuôn dài hoặc elip, dài từ 5-10 mm, tập trung nhiều trên các phiến lá hẹp hơn ở các nhánh phía trên cùng.
1.2.3 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
H cuneiformis là một nguồn tiềm năng của alginat và các sản phẩm tự nhiên khác bao gồm polyphenol, carotene, chlorophyll a, chlorophyll c,mannitol, fucoxanthin, tannins và laminarin Theo như báo cáo về kết quả nghiên cứu thành phần polysaccharide tách chiết từ Rong Nâu Hormophysa cuneiformis thu thập được ở vịnh Nha Trang cho thấy hàm lượng Fucoidan chiếm 2,03% trên trọng lượng rong khô.[25] Mặt khác, đối với các mẫu H. cuneiformis thu được từ Alabat, Quezon (Philippines), hiệu suất axit alginic là
A study reported that 41.8% of the samples collected from Magnetic Island, Queensland, Australia, exhibited a phenolic content of 2.3 ± 0.1% (dry weight) according to the Folin-Denis test In contrast, samples from Qatar in the Arabian Gulf contained 1.2% sterol, which was composed of 3.2% cholesterol, 86.7% fucosterol, and 10.1% 24-methylene-cholesterol.
Chiết xuất metanol và hexan từ Hormophysa articulata (còn gọi là H cuneiformis) đã được nghiên cứu và cho thấy khả năng kháng khuẩn đáng kể, đặc biệt là đối với các vi khuẩn gram dương như Bacillus subtilis và Staphylococcus aureus, cũng như Pseudomonas aeruginosa Tuy nhiên, không có chiết xuất nào thể hiện hoạt tính chống lại Klebsiella pneumoniae.
Hiện nay, nghiên cứu về các loại thuốc chống ung thư hiệu quả từ nguồn tự nhiên đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học Một nghiên cứu gần đây đã sàng lọc hoạt động chống ung thư của 6 loài rong biển khác nhau và phát hiện rằng H cuneiformis là chiết xuất ưu việt nhất trong việc ngăn chặn 4 dòng tế bào ung thư, bao gồm HL60, A549 và HCT116.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu dự kiến là mẫu toàn cây Rong Khế (Hormophysa cuneiformis hay Hormophysa articulata) thu hái tại vùng biển Đồ Sơn thuộc thành phố Hải Phòng
Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu bao gồm việc chọn những mẫu có độ tuổi phù hợp, không quá già cũng không quá non Đối với những mẫu lớn, cần xác định các đặc điểm điển hình thể hiện rõ các cơ quan dinh dưỡng và sinh sản Đối với rong biển, cần chọn mẫu có đầy đủ các bộ phận như đĩa bám, trục chính, các trục phụ, “lá” và túi bào tử.
Thời gian ngiên cứu dự kiến từ tháng 1 năm 2022 tại phòng thực hành
Bộ môn Thực vật – Dược liệu của Trường Đại học Y Dược Hải Phòng.
Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
- Hóa chất nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu của mẫu vật: Javen, acid acetic, xanh methylen 0,5%, đỏ carmin bão hòa, nước cất.
Hóa chất định tính là các thuốc thử dùng để xác định thành phần hóa học có trong mẫu vật Những thuốc thử này không chỉ phục vụ cho phản ứng hóa học mà còn được áp dụng trong kỹ thuật sắc ký lớp mỏng Tất cả các thuốc thử này đều phải đạt tiêu chuẩn theo Dược điển Việt Nam VI để đảm bảo độ chính xác và tin cậy trong quá trình phân tích.
- Dung môi: methanol, ethanol, chloroform, …
2.2.2 Dụng cụ và thiết bị
Tại phòng thực tập Bộ môn Thực vật – Dược liệu, Trường Đại học Y Dược Hải Phòng, các dụng cụ nghiên cứu hình thái và giải phẫu mẫu vật bao gồm kính hiển vi Leica cùng với các thiết bị cắt và lên tiêu bản vi phẫu như đĩa petri, mặt kính đồng hồ, kim mũi mác, phiến kính, lá kính, pipet, dao lam, chổi lông, khoai lang hoặc cà rốt.
- Dụng cụ định tính thành phần hóa học có trong mẫu vật:
Cân kỹ thuật Precisa, cân phân tích độ chính xác 10-3g Ohaus.
Kính hiển vi Primo Star, máy cô quay chân không RV 10 Basic.
Bếp điện, bếp đun cách thủy Memmert, tủ sấy Froilabo.
Bản mỏng tráng sắc ký Sillicagel 60 F254 (Merck).
Ngoài ra, các dụng cụ cần thiết khác bao gồm bình nón với dung tích 50ml, 100ml và 250ml, pipet với các kích thước 1ml, 2ml, 5ml, 10ml và 20ml, cùng với bình chiết quả lê và cốc có mỏ với dung tích 50ml, 100ml và 200ml.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Quá trình thu thập và xử lý mẫu, lên tiêu bản dược liệu khô
2.3.1.1 Thu thập và chuẩn bị mẫu:
Sau khi thu hái, mẫu Rong Khế cần được loại bỏ tạp chất, rửa sạch bằng nước sạch và sử dụng bàn chải mềm để chải sạch muối và đất cát bám trên bề mặt.
2.3.1.2 Ép và sấy mẫu tiêu bản Ép và sấy cho mẫu khô là hai quá trình không tách rời nhau, trong khi sấy cần ép chặt mẫu để lá khỏi nhăn nheo, để mẫu cây nằm đúng vị trí đính dán mẫu Sắp xếp rong trên giấy trắng và dưới một lớp giấy thấm để cố định trước khi sấy.
Lưu ý một số nguyên tắc khi sắp xếp:
- Trong số các lá ít nhất có một lá được lật lên.
- Không để đè các bộ phận của cây đè lên nhau.
- Cần sắp xếp đều trên diện tích cho phép.
- Cây dài có thể xếp theo hình chữ V, N hay hình khác.
- Nếu cần bỏ lá chú ý giữ cuống lá.
- Những phẩn nhỏ bị rụng cần đặt bên cạnh mẫu.
Các bộ phận dùng làm thuốc có thể được bảo quản bằng phương pháp phơi sấy khô hoặc ngâm trong dung dịch bảo quản Để thực hiện, hãy đặt các mẫu vào cặp ép (không dày quá 40cm), buộc cặp ép lại và tiến hành sấy khô.
35 – 40ºC trong khoảng 8 – 12 giờ Trong quá trình sấy cần thường xuyên thông thoáng Lấy cặp ép ra buộc lại và sấy tới khô.
2.3.1.3 Khâu hoặc dán mẫu cây lên tiêu bản
Giấy khâu có kích thước 35 x 47 cm, thường được làm từ bìa trắng, và đối với mẫu lớn, cần sử dụng giấy dày hơn Đặt mẫu rong đã được ép và sấy khô lên bìa, sau đó khâu và dán giấy lên các nốt khâu ở mặt trái Khi hoàn tất việc khâu và dán, ở góc phải phía dưới của tiêu bản, dán nhãn kích thước 8 x 13 cm theo mẫu đã quy định.
2.3.2 Nghiên cứu về đặc điểm hình thái, giải phẫu rong
Phương pháp đánh giá bằng cảm quan bao gồm việc quan sát và mô tả các đặc điểm hình thái của mẫu Rong Khế, cả khi tươi lẫn khi khô sau khi được ngâm trong nước trong 12 tiếng.
- Phương pháp làm tiêu bản vi học thực vật: Quan sát đặc điểm vi phẫu
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG
Bộ môn Thực vật – Dược liệu ––––––––––––––––––––
Người định danh: thực vật thông qua lát cắt ngang thân và ngang lá mẫu cây Rong Khế bằng kính hiển vi ở vật kính 10x và 40x.
Để làm tiêu bản vi học thực vật, cần sử dụng một phần lá và thân của cây Rong Khế khô đã được ngâm nước cho trương nở tự nhiên Tiến hành cắt vi phẫu bằng dụng cụ cầm tay, chọn các lát mỏng nguyên vẹn để chuẩn bị lên tiêu bản Sau đó, thực hiện quá trình tẩy và nhuộm tiêu bản, và cuối cùng, vi phẫu đã nhuộm sẽ được lên kính theo phương pháp giọt ép.
2.3.3 Nghiên cứu về thành phần hóa học của Rong Khế
2.3.3.1 Định tính các nhóm chất trong Rong Khế dựa trên các phản ứng hóa học:
Lấy 10g dược liệu cho vào bình nón 50ml, thêm 15ml dung dịch H2SO4 2% để ngập dược liệu Đun sôi, sau đó để nguội và lọc dịch chiết vào bình gạn Tiến hành kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch Amoniac 6N đến pH 9 – 10, kiểm tra bằng giấy quỳ tím hoặc chỉ thị vạn năng Cuối cùng, chiết alkaloid bằng chloroform.
Dịch chiết chloroform được thực hiện 3 lần, mỗi lần 5ml, sau đó được gộp lại và lắc với H2SO4 2% trong 2 lần, mỗi lần 5ml Các dịch chiết nước được gộp lại và chia vào 3 ống nghiệm, mỗi ống chứa khoảng 1ml, để tiến hành các phản ứng tiếp theo.
- Phản ứng với thuốc thử (TT) Bouchardat - H 3 [P(Mo 3 O 10 ) 4 ]:
Nếu xuất hiện kết tủa trắng thì phản ứng dương tính.
- Phản ứng với TT Mayer - K 2 HgI 4 :
Nếu xuất hiện kết tủa trắng thì phản ứng dương tính.
- Phản ứng với TT Dragendorff - KBiI 4:
Nếu xuất hiện kết tủa da cam thì phản ứng dương tính.
Cân 5g dược liệu vào bình nón dung tích 250ml Thêm 100ml ethanol(EtOH) 25º rồi ngâm trong 24h Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ dung tích
250ml Thêm 3ml chì acetat 30% khuấy đều lọc qua giấy lọc gấp nếp vào cốc có mỏ dung tích 250ml.
Để kiểm tra lượng chì acetat đã đủ hay chưa, hãy nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm và thêm một giọt chì acetat Nếu có tủa xuất hiện, ngừng lọc và thêm khoảng 1ml chì acetat 30% vào toàn bộ dịch chiết Sau đó, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử cho đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat.
Chuyển dịch lọc vào bình gạn 250ml và lắc kỹ với 8ml CHCl3 hai lần Gạn dịch chiết CHCl3 vào cốc có mỏ, gộp các dịch chiết và loại nước bằng Na2SO4 khan Chia đều dịch chiết vào ba ống nghiệm nhỏ đã sấy khô, sau đó đặt lên giá và bốc hơi trên nồi cách thủy cho đến khi khô Cắn thu được sẽ được tiến hành các phản ứng tiếp theo.
- Phản ứng Liebermann- Burchardat: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn
1ml anhydric acetic Lắc đều cho tan hết cắn Nghiêng ống 45 o Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống
Nếu giữa 2 chất lỏng trong ống xuất hiện vòng tròn màu đỏ tím thì phản ứng dương tính.
- Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml EtOH 90º, lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ 1 giọt TT Natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%, lắc đều
Nếu dung dịch trong ống nghiệm xuất hiện màu đỏ cam thì phản ứng dương tính.
Phản ứng Baljet được thực hiện bằng cách cho vào ống nghiệm 0,5ml EtOH 90º và lắc đều để hòa tan Sau đó, nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha, bao gồm 1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%.
Nếu xuất hiện màu đỏ cam thì phản ứng dương tính.
- Phản ứng Keller – Kiliani: Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml EtOH
Lắc đều dung dịch để tan hoàn toàn, sau đó thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5% đã pha trong acid acetic Tiếp tục lắc đều và nghiêng ống nghiệm 45 độ Nhỏ từ từ 0,5ml acid sulfuric đặc theo thành ống, cẩn thận để không xáo trộn các chất lỏng bên trong.
Nếu ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng thấy xuất hiện vòng tím đỏ thì phản ứng dương tính.
- Phản ứng Borntraeger: Cho 5g dược liệu vào bình nón dung tích
Thêm 10ml dung dịch H2SO4 25% vào 100ml để ngập dược liệu và đun sôi trong vài phút Sau khi nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn và lắc với 5ml CHCl3 Lấy 1ml dịch CHCl3 thu được cho vào ống nghiệm, sau đó thêm 1ml NaOH 10% và lắc kỹ.
Nếu quan sát thấy lớp NaOH có màu đỏ thì phản ứng dương tính.
Lấy 10g dược liệu cho vào bình nón 100 ml, thêm 50 ml EtOH 90º và đun cách thủy trong 5 phút Sau đó, lọc nóng và cô dịch lọc lại đến 9-10 ml để tiến hành thử các phản ứng tiếp theo.
- Phản ứng với hơi amoniac (NH 3 ): Nhỏ một giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô rồi hơ trên miệng lọ có chứa amoniac đặc đã mở nút
Nếu tờ giấy lọc sau khi được sấy và hơ trên miệng lọ amoniac có vệt màu vàng đậm thì phản ứng dương tính.
- Phản ứng với dung dịch kiềm loãng (NaOH 10%): Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%.
Nếu xuất hiện tủa màu vàng thì phản ứng dương tính.
Để thực hiện phản ứng Cyanidin, cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết và thêm khoảng 10mg bột Magie kim loại Tiếp theo, nhỏ từ 3-5 giọt HCl đậm đặc vào ống nghiệm, sau đó để yên trong vài phút và quan sát sự thay đổi.
Nếu xuất hiện màu đỏ cam (vàng cam) đậm hơn ban đầu thì phản ứng dương tính
- Phản ứng với dung dịch sắt (III) chlorid: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%.
Nếu xuất hiện màu xanh đen thì phản ứng dương tính.
Cho 5g dược liệu vào bình nón, thêm 20 ml EtOH 90º, đun cách thủy sôi 3 - 5 phút, lọc nóng Dịch lọc thu được tiến hành các phản ứng sau:
- Phản ứng đóng mở vòng lacton:
Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết: Ống 1: Thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%. Ống 2: Giữ nguyên.
Đun cách thủy cả 2 ống nghiệm đến sôi, để nguội Nếu ống 1 có tủa đục vàng, ống 2 trong thì tiếp tục tiến hành:
Thêm vào cả 2 ống nghiệm, mỗi ống 1ml nước cất, lắc đều, ống
1 trong suốt, ống 2 có tủa đục.
Thêm vài giọt HCl đặc vào ống 1, nếu ống 1 đục trở lại như ống
2 thì phản ứng dương tính.
DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu đặc điểm thực vật
3.1.1 Đặc điểm hình thái ngoài
Quan sát và ghi lại đặc điểm hình thái cơ bản của Rong Khế bao gồm:
- Cụm Rong: Rong H cuneiformis mọc thành bụi nhỏ, tản rong cao từ
- Màu sắc: Rong có màu nâu vàng.
- Đĩa bám: nhỏ dạng rễ giả hình trụ, phân nhánh chằng chịt, giúp thân rong bám vững chắc trong môi trường nước chuyển động mạnh.
- Trục chính: rất ngắn, mang 2 – 3 nhánh chính hình trụ, đường kính từ
1 – 2 mm, phân thành nhiều nhánh bên, sắp xếp xen kẽ các nhánh theo mọi hướng, trong nhiều mặt phẳng
Lá có hình dạng mỏng, bầu dục dài hoặc giống mũi giáo, thường mọc thành cụm với số lượng lớn Chiều dài của phiến lá dao động từ 0,5 đến 3 cm và rộng tối đa 4 mm, mép lá có răng cưa lớn Cuống lá thon và gân lá rõ nét.
Phao là cấu trúc hình thành dạng chuỗi nằm giữa lá và nhánh, có hình thuôn dài hoặc hình elip, kích thước từ 5-10 mm Chúng thường tập trung nhiều trên các phiến lá hẹp hơn, đặc biệt ở các nhánh phía trên cùng.
Lên tiêu bản vi phẫu của thân Rong Khế và quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 10x và 40x Mô tả đặc điểm vi phẫu của thân Rong Khế từ cấu tạo bên ngoài vào bên trong một cách chi tiết.
Lên tiêu bản vi phẫu và quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 10x và 40x, chúng ta sẽ mô tả đặc điểm vi phẫu của "lá" Rong Khế theo cấu trúc từ ngoài vào trong Quan sát đầu tiên là lớp biểu bì, tiếp theo là lớp mô mềm, sau đó là các bó mạch và cuối cùng là phần mô mạch Các đặc điểm này giúp hiểu rõ hơn về cấu trúc và chức năng của lá Rong Khế trong sinh thái học.
Nghiên cứu về thành phần hóa học
3.2.1 Định tính các nhóm chất trong Rong Khế dựa trên các phản ứng hóa học
Tiến hành các phản ứng hóa học một cách tuần tự nhằm xác định các nhóm chất có trong Rong Khế Kết quả định tính sẽ được trình bày trong bảng dưới đây.
STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận
1 Saponin Hiện tượng tạo bọt
P/ứ với TT Mayer P/ứ với TT Dragendorff P/ứ với TT Bouchardat
P/ứ với hơi ammoniac P/ứ với FeCl3
6 Coumarin P/ứ đóng mở vòng lacton
8 Đường khử P/ứ với TT Fehling
9 Chất béo Vết mờ trên giấy lọc
10 Sterol P/ứ với H2SO4/anhydride acetic
12 Acid hữu cơ Xuất hiện bọt khí
13 Acid amin P/ứ với TT Ninhydrin
15 Polyphenol P/ứ với TT Folin – Ciocalteu
Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất trong Rong Khế
3.2.2: Định tính bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM)
Chiết siêu âm 10g mẫu rong biển với 50 ml MeOH trong 1 giờ, sau đó cất dịch chiết dưới áp suất giảm bằng máy cô quay cho đến khi khô Độ ẩm của cao dược liệu được xác định, sau đó hòa tan cao toàn phần vào khoảng 20ml nước cất nóng để tạo hỗn dịch Hỗn dịch này được lắc và chiết phân đoạn lần lượt với n-hexan (25ml, chia làm 3 lần: 10, 10, 5ml) và ethylacetat (25ml, chia làm 3 lần: 10, 10, 5ml) nhằm thu được các phân đoạn với độ phân cực tăng dần: n-hexan, ethylacetat, nước Các phân đoạn này được làm khô và được sử dụng để định tính bằng phương pháp SKLM.
Cao toàn phần và cao phân đoạn được hòa tan trong methanol (MeOH) thu được dịch chiết có nồng độ 1mg/ml để tiến hành chấm sắc ký.
- Thuốc thử: dd H2SO4 10% trong EtOH.
Hệ dung môi triển khai sắc ký: n-hexan:ethyl acetat (5:1)
Quan sát bản mỏng ở ánh sáng thường; dưới ánh sáng UV (ở bước sóng
254 nm, 366 nm) và sau khi hiện màu bằng TT H2SO4 10% trong EtOH.
DỰ KIẾN BÀN LUẬN
Về đặc điểm thực vật
Mẫu nghiên cứu cho thấy các đặc điểm hình thái thực vật chung của họ Rong mơ Sargassaceae, bao gồm cơ quan bám dạng rễ phân nhánh phát triển, mép lá có răng cưa lớn, và sự hiện diện của cơ quan chứa không khí gọi là phao, tạo thành chuỗi giữa lá và nhánh với hình dáng thuôn dài hoặc elip.
Mẫu rong thu hái có đầy đủ các đặc điểm hình thái và vi phẫu của loài H cuneiformis, bao gồm lá và thân Vì vậy, mẫu rong này có thể được sơ bộ định danh là Hormophysa cuneiformis (J F Gmelin) P C Silva, hay còn gọi là Rong Khế trong tiếng Việt.
Về thành phần hóa học
4.2.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học
Kết quả định tính sơ bộ cho thấy dược liệu này chứa các nhóm chất quan trọng thông qua các phản ứng hóa học đặc trưng Đặc biệt, mẫu nghiên cứu cho thấy sự dương tính mạnh với
4.2.2 Kết quả định tính bằng sắc ký lớp mỏng.
Sắc ký đồ quan sát dưới ánh sáng thường và tia UV (254nm, 366nm), cùng với hiện màu bằng TT H2SO4 10% trong cồn, cho thấy các phân đoạn chứa hợp chất hữu cơ, tạo cơ sở cho việc phân lập các hoạt chất có hoạt tính sinh học cao trong Rong Khế Nghiên cứu trước đó đã chỉ ra rằng H cuneiformis là chiết xuất hiệu quả nhất trong việc ngăn chặn 4 dòng tế bào ung thư, bao gồm HL60, A549, và HCT116.
DỰ KIẾN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Dự kiến kết luận
Sau khi nghiên cứu và thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu và thành phần hóa học của Rong Khế (Hormophysa cuneiformis) thu hái tại Hải Phòng”, chúng tôi đã rút ra một số kết luận quan trọng về đặc điểm hình thái, cấu trúc giải phẫu và thành phần hóa học của loài rong này.
- Loài Rong Khế thu hái tại Hải Phòng sơ bộ xác định tên khoa học là…
- Qua định tính sơ bộ cho thấy loài Rong Khế có thành phần hóa học chính là …
Sau khi thực hiện quá trình SKLM, dung môi n-hexan:EA đã được lựa chọn với tỷ lệ tối ưu để đạt được kết quả tách tốt nhất Sắc ký đồ thu được được quan sát dưới ánh sáng thường và tia UV ở 254nm và 366nm, đồng thời được hiện màu bằng thuốc thử H2SO4 10% trong cồn.
Dự kiến kiến nghị
Từ những kết quả thu được, đề tài đưa ra một số kiến nghị như sau:
- Tiếp tục tiến hành chiết xuất và phân lập các hợp chất chính từ loài Rong Khế này.
- Tiến hành nghiên cứu khả năng ức chế một số dòng tế bào ung thư từ dịch chiết Rong Khế.
1 Thu thập và chuẩn bị mẫu
2 Lên tiêu bản dược liệu khô
Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu
4 Định tính bằng phản ứng hóa học