bài tiểu luận tìm hiểu về các kĩ thuật protein, sinh học phân tử để cải tiến enzyme theo hướng tăng tính đặc hiệu và hoạt tính xúc tác được ứng dụng phổ biến hiện nay. Được thể hiện qua từng đề mục rõ ràng chi tiết kèm theo các hình ảnh minh họa, ...
GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ ENZYM
Lịch sử nghiên cứu và phát triển công nghệ enzyme
Enzyme học được xem là nền tảng của hóa sinh học, vì vậy hầu hết các nghiên cứu trong lĩnh vực hóa sinh đều gắn liền với enzyme.
Về sự phát triển của học thuyết enzyme, có thể chia thành 4 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: trước thế kỷ thứ XVII
- Giai đoạn 2: từ thế kỷ XVII đến nửa đầu thế kỷ XIX
- Giai đoạn 3: từ giữa thế kỷ XIX đến 30 năm đầu của thế kỷ XX
- Giai đoạn 4: từ những năm 30 của thế kỷ XX đến nay
Trước thế kỷ XVII, con người đã sử dụng các quá trình enzyme trong đời sống hàng ngày, chủ yếu thông qua kinh nghiệm thực tế và hoạt động của vi sinh vật, như trong sản xuất rượu, muối dưa, làm tương và nước chấm Tuy nhiên, vào thời điểm này, bản chất của enzyme và các quá trình lên men vẫn chưa được hiểu rõ Nhiều tài liệu cổ từ Babylon, Hy Lạp, Trung Quốc và Ấn Độ đã ghi chép về những vấn đề này.
Giai đoạn 2 chứng kiến các nhà khoa học nghiên cứu sâu về bản chất của quá trình lên men Họ đã nhận định rằng lên men là hiện tượng phổ biến trong sự sống, và enzyme đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa các chất trong quá trình này.
Vào thế kỷ XVII, Van Helmont là người đầu tiên nghiên cứu sâu về bản chất của quá trình lên men Ông nhận ra rằng tiêu hóa thực chất là một quá trình chuyển hóa hóa học của thức ăn và đã so sánh cơ chế này với quá trình lên men rượu Thuật ngữ "ferment" (xuất phát từ tiếng Latinh "fermentatio") được Van Helmont sử dụng để chỉ tác nhân gây ra sự chuyển biến chất trong quá trình lên men rượu.
Vào nửa cuối thế kỷ XVIII, nhà tự nhiên học người Pháp Réaumur đã nghiên cứu sự tiêu hóa bằng cách cho chim quạ đen nuốt thịt qua ống kim loại, và không thấy gì trong ống sau vài giờ Hiện tượng này đã dẫn đến nghiên cứu về dịch tiêu hóa để hiểu khả năng tiêu hóa của dạ dày Năm 1783, nhà bác học người Ý Spalanzani đã lặp lại thí nghiệm, trộn dịch dạ dày với thịt mới và quan sát hiện tượng hòa tan xảy ra.
Vào đầu thế kỷ XIX, các nhà nghiên cứu đã phân lập được các chất liên quan đến quá trình lên men Năm 1814, Kirchoff, viện sĩ tại Saint Petersburg, phát hiện rằng nước chiết từ mầm đại mạch có khả năng chuyển hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ thường Đây là công trình đầu tiên thu được chế phẩm amylase dưới dạng dung dịch, đánh dấu sự khởi đầu cho lịch sử enzyme học.
Năm 1833, hai nhà khoa học Pháp là Payen và Pessoz đã phát hiện ra enzyme amylase có khả năng phân giải tinh bột thành đường Qua thí nghiệm, khi cho etanol vào dịch chiết lúa đại mạch nảy mầm, họ quan sát thấy kết tủa xuất hiện, có khả năng chuyển hóa tinh bột Tuy nhiên, khi đun nóng kết tủa này, nó sẽ mất tác dụng chuyển hóa Từ "diastase" (xuất phát từ chữ Latinh diastasis, nghĩa là phân cắt) được Payen và Pessoz sử dụng để chỉ enzyme này.
Năm 1836, các nhà khoa học người Đức Emberle và Shwan đã phát hiện và tách được nhiều enzyme quan trọng, trong đó có enzyme Pepsin, có khả năng phân giải protein trong dịch tiêu hóa ở dạ dày.
Lý thuyết xúc tác được hình thành vào năm 1835 khi nhà khoa học Berzelius cho rằng việc tăng tốc độ phản ứng là hiện tượng xúc tác Mặc dù đây là một quan điểm đúng, nhưng ông lại cho rằng các chất xúc tác hoạt động nhờ "lực sống" mà không thể kiểm soát bởi con người Quan điểm duy tâm này đã gây cản trở cho sự phát triển của khoa học, đặc biệt là trong lĩnh vực enzyme học.
Từ giữa thế kỷ XIX đến ba thập kỷ đầu của thế kỷ XX, đã có sự tách chiết một lượng lớn enzyme ở dạng hòa tan.
Trong thời kỳ này, hai trường phái khoa học đang đối đầu là trường phái của Pasteur, một nhà bác học vĩ đại người Pháp, và trường phái của Liebig, một nhà bác học nổi tiếng người Đức.
Bản chất hóa học của enzyme chỉ được xác định chính xác sau khi enzyme được kết tinh Năm 1926, nhà hóa sinh trẻ tuổi người Mỹ, Sumner, đã chứng minh rằng protein kết tinh từ hạt đậu tương có khả năng xúc tác cho phản ứng thủy phân urê, đánh dấu enzyme đầu tiên được kết tinh Đến năm 1930, Northrop đã tách được pepsin ở dạng tinh thể, và vào năm 1931, Northrop cùng Kunitz đã tách được trypsin ở dạng tinh thể.
Trong thời kỳ này, J.B.S Hardane đã cho ra mắt cuốn sách "Enzymes", trong đó ông đưa ra những dự đoán quan trọng về vai trò của các tương tác và liên kết yếu giữa enzyme và cơ chất, mặc dù bản chất phân tử của enzyme vẫn còn là một bí mật Những quan điểm này vẫn giữ nguyên tính thời sự và có giá trị trong thời đại ngày nay.
Các công trình của Sumner và Northrop đã đánh dấu một bước ngoặt quan trọng trong lịch sử enzyme học hiện đại, xác định rằng phần lớn enzyme có bản chất hóa học là protein Tuy nhiên, sau phát hiện của T.R Cech vào năm 1981 về ribozyme – một loại RNA có khả năng xúc tác – định nghĩa cổ điển về enzyme cần được xem xét lại, vì enzyme không nhất thiết phải là protein Phát minh này, mang lại ý nghĩa to lớn cho khoa học, đã giúp xác định khoảng 100 ribozyme được biết đến cho đến nay Những nghiên cứu này đã khởi đầu cho giai đoạn thứ tư trong sự phát triển của enzyme học, kéo dài cho đến ngày nay.
Từ giữa thế kỷ XX, enzyme học đã có sự phát triển mạnh mẽ, đặc biệt trong thời gian gần đây Sự ứng dụng của các phương pháp hiện đại như điện di, sắc ký, quang phổ và đồng vị phóng xạ đã giúp nghiên cứu cấu trúc, cơ chế tác dụng của nhiều enzyme, quá trình sinh tổng hợp enzyme và sự điều hòa hoạt động của enzyme trong tế bào.
Khái niệm về enzyme
Trong cơ thể sống, quá trình trao đổi chất diễn ra liên tục và là yếu tố quyết định sự tồn tại của sự sống Quá trình này bao gồm nhiều phản ứng hóa học phức tạp, có mối liên hệ chặt chẽ và điều chỉnh lẫn nhau Enzyme, các hợp chất protein, đóng vai trò xúc tác cho các phản ứng hóa học này, giúp chúng diễn ra theo một chiều hướng nhất định và với tốc độ nhịp nhàng, đảm bảo sự hoạt động hiệu quả trong cơ thể.
Enzym là chất xúc tác sinh học, được tạo ra trong tế bào sinh vật, có bản chất protein, hòa tan trong nước và trong dung dịch muối loãng
Enzyme có mặt trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống và được gọi là các chất xúc tác sinh học (biocatalysators) do có nguồn gốc từ các tác nhân xúc tác sinh học, nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học.
Cấu trúc phân tử của Enzyme
E có khả năng và hiệu lượng
Các E là protein được hình thành từ 20 loại 𝛼-amino acid, kết hợp với nhau qua liên kết peptid Liên kết này được tạo ra từ phản ứng giữa nhóm 𝛼-carbony của amino acid trước với nhóm 𝛼-amino của amino acid tiếp theo, đồng thời loại bỏ một phân tử nước Kết quả là các liên kết peptid tạo thành một mạch thẳng không phân nhánh, có hai đầu được gọi là “đầu N” và “đầu C”, với các gốc amino acid được đánh số bắt đầu từ “đầu N” Trong một số trường hợp, hai đầu này có thể kết hợp với nhau, tạo thành phân tử có cấu trúc vòng.
Giống như các loại protein khác, E có thể tồn tại dưới hai dạng: protein đơn giản (E một thành phần) và protein phức tạp (E hai thành phần hay holoE) HoloE là một phân tử bao gồm hai thành phần chính: phần protein và phần không phải protein.
Các bậc cấu trúc cảu phân tử:
E là protein hình hạt, vì vậy cũng có các bậc cấu trúc như protein: bậc I, II, III,
Trình tự xếp các amino acid (a.a) trong phân tử enzyme (E) được giữ vững nhờ liên kết peptid, đóng vai trò quan trọng trong việc xác định cấu trúc không gian của enzyme Sự thay đổi một hoặc một vài a.a có thể ảnh hưởng đến quá trình tiến hóa của enzyme, tuy nhiên, các gốc a.a có vai trò xúc tác trong trung tâm hoạt động của enzyme vẫn không bị biến đổi.
Là cấu trúc không gian cục bộ, phổ biến nhất là cấu trúc xoắn 𝛼, phiến gấp nếp
Cấu trúc bậc II chủ yếu được duy trì nhờ các liên kết hydrogen Tỷ lệ phần trăm của các kiểu cấu trúc bậc II và tỷ lệ của từng kiểu cấu trúc trong phân tử của các E khác nhau có sự khác biệt rõ rệt.
Cấu trúc bậc III của chuỗi polypeptide được hình thành khi các gốc ở xa nhau trong chuỗi được xích lại gần nhau trong không gian, tạo nên hình dạng chung của chuỗi Đặc tính cấu trúc và độ bền của cấu trúc này chủ yếu phụ thuộc vào các tương tác yếu như liên kết hydrogen, tương tác ion giữa các nhóm tích điện trái dấu, tương tác Van der Waals, và tương tác kỵ nước giữa các nhóm không phân cực.
Các protein/E oligomer được hình thành từ hai hoặc nhiều chuỗi polypeptide kết hợp với nhau thông qua các tương tác phi cộng hóa trị Cấu trúc bậc IV của các E này được phân loại dựa trên số lượng các polypeptide trong phân tử, dẫn đến các tên gọi khác nhau tương ứng.
Thành phần cấu tạo của enzyme
Enzyme có thể được phân loại thành hai nhóm chính: enzyme một thành phần và enzyme hai thành phần Enzyme một thành phần là những enzyme có cấu trúc đơn giản, chỉ bao gồm protein Trong khi đó, enzyme hai thành phần là những enzyme phức tạp, bao gồm cả protein và một nhóm ngoại không phải protein.
Phần protein của enzyme hai thành phần được gọi là apoprotein hay apoenzyme, trong khi phần không phải protein được gọi là nhóm ngoại hoặc coenzyme Nhóm ngoại thường là các chất hữu cơ đặc hiệu có thể liên kết chặt chẽ hoặc lỏng lẻo với apoenzyme Coenzyme dễ tách ra khỏi apoenzyme và có thể tồn tại độc lập, trong khi nhóm prosthetic liên kết chặt chẽ với phần protein Phức hợp hoàn chỉnh giữa apoenzyme và coenzyme được gọi là holoenzyme, có vai trò quan trọng trong việc xúc tác các phản ứng chuyển hóa Coenzyme tham gia trực tiếp vào phản ứng, quyết định kiểu phản ứng mà enzyme xúc tác và nâng cao độ bền của apoenzyme Apoenzyme lại nâng cao hoạt tính xúc tác của coenzyme và xác định tính đặc hiệu của enzyme Phân biệt giữa coenzyme và nhóm ngoại là tương đối, do nhiều coenzyme cũng có thể liên kết với apoenzyme bằng liên kết đồng hóa trị Ngoài ra, nhiều enzyme còn chứa kim loại, đặc biệt là enzyme thuộc các lớp 1, 2, 4, 5, 6, trong khi enzyme thủy phân (lớp 3) thường là enzyme một thành phần cần ion kim loại làm đồng yếu tố.
*Trung tâm hoạt động của enzyme
Enzyme là một loại protein đặc biệt với cấu trúc phức tạp Chỉ một phần nhỏ trong cấu trúc của enzyme, được gọi là trung tâm hoạt động, tham gia vào quá trình xúc tác phản ứng Trung tâm hoạt động này có tính đặc hiệu cao, cho phép enzyme thực hiện chức năng của mình một cách hiệu quả.
Trong quá trình xúc tác của enzym, chỉ một phần gọi là "trung tâm hoạt động" tham gia trực tiếp vào phản ứng để kết hợp với cơ chất Cấu trúc đặc biệt của trung tâm hoạt động quyết định tính đặc hiệu và hoạt tính xúc tác của enzym Trung tâm hoạt động của enzym bao gồm các thành phần quan trọng.
- Những nhóm hóa học, những liên kết peptide tiếp xúc trực tiếp với cơ chất
- Những nhóm hóa học, những liên kết peptide không tiếp xúc trực tiếp với cơ chất nhưng có chức năng trực tiếp trong quá trình tiếp xúc
The active site of enzymes typically comprises amino acids with strong functional groups, including serine, histidine, cysteine, arginine, glutamic acid, aspartic acid, and tryptophan These chemical groups play a crucial role in binding with substrates to form enzyme-substrate complexes.
- Các nhóm chức của trung tâm hoạt động của enzyme:
+ Nhóm γ-carboxyl của glutamic acid
Ngoài các nhóm chức hóa học, trung tâm hoạt động enzyme còn có các ion kim loại như Fe 2+ , Zn 2+ , Mg 2+ , Mn 2+ và các nhóm chức của co-enzyme
Trong "enzym 1 cấu tử", các acid amin phân bố không đồng nhất trên mạch polypeptid, nhưng chúng lại nằm gần nhau trong không gian để hình thành trung tâm hoạt động Sự kết hợp giữa các nhóm chức của các acid amin thường thấy là
SH của cysteine, -OH của serine, vòng imidazol của histidine, w-COOH của aspartie và acid glutamic, -COOH của các acid amin cuối mạch
Enzym hai cấu tử bao gồm mạch polypeptid và các nhóm chức kết hợp để hình thành trung tâm hoạt động Ngoài ra, coenzym và các nhóm ngoại khác cũng góp phần tạo nên trung tâm này Đặc biệt, trong các enzym chứa kim loại, các ion kim loại tham gia vào việc hình thành trung tâm hoạt động.
Trong các nhóm chức tham gia tạo trung tâm hoạt động cần phân biệt hai nhóm:
"tâm xúc tác" (tham gia trực tiếp vào hoạt động xúc tác của enzym) và "nền tiếp xúc" (giúp enzym kết hợp đặc hiệu với cơ chất)
Mỗi enzyme thường có một trung tâm hoạt động, tuy nhiên, một số enzyme như alcohol hydrogenase của gan có hai trung tâm hoạt động, trong khi alcohol dehydrogenase của nấm men có tới bốn trung tâm hoạt động.
Hoạt động xúc tác của enzyme có liên quan đến cơ chất với những điểm quan trọng sau:
Chỉ những cơ chất có cấu trúc phân tử phù hợp với trung tâm hoạt động của enzyme mới có khả năng kết hợp để tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất, thể hiện tính đặc hiệu của enzyme.
- Các enzyme thường tạo ra trung tâm hoạt động có cấu trúc không gian nhất định
Trung tâm hoạt động của enzyme hình thành khi có sự tương tác với cơ chất, dẫn đến sự di chuyển và định hướng chính xác của các amino acid và nhóm chức Quá trình này cho phép cơ chất gắn kết vào trung tâm hoạt động, từ đó thực hiện chức năng xúc tác hiệu quả.
Hình 1.1: Cơ chế hoạt động của Enzyme
Trong giai đoạn đầu tiên, enzyme kết hợp với cơ chất thông qua các yếu tố liên kết, hình thành nên phức hệ enzyme - cơ chất Phức hệ này thường không bền vững và quá trình tạo ra nó diễn ra nhanh chóng, yêu cầu ít năng lượng.
Giai đoạn thứ hai của quá trình enzymatic diễn ra khi cơ chất kết hợp với enzyme, dẫn đến sự thay đổi cấu hình không gian và độ bền của các liên kết Kết quả của quá trình này là sự phá vỡ các liên kết, tạo ra sản phẩm mới.
Giai đoạn thứ ba: Đây là cuối cùng của giai đoạn, sản phẩm quá trình phản ứng được tạo thành và tách ra khỏi enzyme
Cơ chế tác động tổng quát của enzyme:
E- Enzym (enzym) S- Cơ chất (Substrate) P- Sản phẩm (Products)
Bản chất hóa học của enzyme
Gần một thế kỷ trước, các nhà khoa học đã nỗ lực xác định bản chất hóa học của enzyme, và hiện nay, hầu hết enzyme đều là protein, ngoại trừ một nhóm nhỏ phân tử RNA có hoạt tính xúc tác Hoạt tính xúc tác của enzyme phụ thuộc vào cấu trúc bậc 1, 2, 3 và 4 của protein cũng như trạng thái tự nhiên của chúng Bản chất hóa học của enzyme chỉ được xác định chính xác sau khi enzyme được tinh thể hóa, với urease từ đậu tương là enzyme đầu tiên được tinh thể hóa vào năm 1926 Tiếp theo là pepsin và trypsin, và nhiều enzyme khác cũng đã được tinh thể hóa, xác nhận rằng các tinh thể protein chính là enzyme.
Nghiên cứu về tính chất hóa lý của enzyme cho thấy enzyme sở hữu các thuộc tính hóa học tương tự như protein, với phần lớn enzyme có hình dạng cầu Tỷ lệ giữa trục dài và trục ngắn của phân tử enzyme dao động trong khoảng 1 - 2 hoặc 4 - 6.
Enzyme có khối lượng phân tử rất đa dạng, dao động từ 12.000 đến hơn 1.000.000 dalton Chẳng hạn, ribonuclease có khối lượng phân tử là 12.700, trong khi glutamat dehydrogenase đạt tới 1.000.000 dalton Phần lớn enzyme thường nằm trong khoảng khối lượng phân tử từ 20.000 đến 90.000, hoặc có thể lên đến vài trăm nghìn dalton.
Do kích thước phân tử lớn, enzyme không thể qua màng bán thấm Chúng tan trong nước, tạo thành dung dịch keo, và cũng hòa tan trong dung dịch muối loãng, glycerin, cùng các dung môi hữu cơ có cực khác Enzyme không bền, dễ bị biến tính khi gặp nhiệt độ cao, dẫn đến mất khả năng xúc tác Mức độ giảm hoạt tính của enzyme tỷ lệ thuận với mức độ biến tính của protein trong chế phẩm Ngoài ra, kiềm, acid mạnh và kim loại nặng cũng gây biến tính cho enzyme Giống như protein, enzyme có tính chất lưỡng tính.
Những enzyme trong nhóm này chỉ được cấu tạo từ một thành phần hóa học duy nhất, đó là protein Các enzyme này được gọi là enzyme đơn giản, vì chúng chỉ bao gồm protein mà không có bất kỳ thành phần nào khác.
Thuộc nhóm này bao gồm những E có 2 thành phần:
- phần protein thuần được gọi là apoprotein hay apoenzym
Phần thứ hai của enzyme là các chất hữu cơ không phải protein, có vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy quá trình xúc tác Đối với các enzyme đa cấu tử, apoenzym chịu trách nhiệm xúc tác, nhưng nếu thiếu các chất hữu cơ đặc hiệu, enzyme sẽ không hoạt động hiệu quả Những chất hữu cơ này có thể gắn chặt hoặc lỏng lẻo với phần protein của enzyme.
Bản chất sinh học của E
E là một loại protein được sinh vật tổng hợp nên và tham gia vào các quá trình phản ứng sinh học
Bản chất sinh học của enzyme (E) là kết quả của các quá trình sinh học và các phản ứng sinh hóa diễn ra trong và ngoài tế bào Tất cả các loại enzyme đều có những đặc tính sinh học chung, bao gồm khả năng xúc tác các phản ứng hóa học và tham gia vào các quá trình sinh lý quan trọng trong cơ thể sinh vật.
- E được tạo ra trong tế bào sinh vật
- E tham gia phản ứng trong điều kiện nhiệt độ ôn hào
- E tham gia phản ứng cả trong tế bào sống và cả khi E được tách khỏi tế bào sống
Enzymes có vai trò xúc tác các phản ứng hóa học cả bên trong và bên ngoài cơ thể, từ giai đoạn khởi đầu cho đến khi giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong các hợp chất hóa học.
- E có thể được thực hiện một phản ứng
- Phản ứng E là những phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít
- E chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng
TÍNH ĐẶC HIỆU CỦA ENZYME
Khái niệm chung
Enzyme có cấu trúc lý hóa đặc biệt, đặc biệt là ở trung tâm hoạt động, cho phép chúng có tính đặc hiệu cao so với các chất xúc tác thông thường Mỗi enzyme chỉ xúc tác cho một hoặc một số chất nhất định trong các phản ứng cụ thể Đặc tính này được gọi là tính đặc hiệu hoặc tính chuyên hóa của enzyme, và đây là một trong những đặc điểm quan trọng nhất của enzyme.
Các hình thức đặc hiệu
Có thể phân biệt hai kiểu đặc hiệu: đặc hiệu kiểu phản ứng và đặc hiệu cơ chất
2.2.1 Đặc hiệu kiểu phản ứng
Mỗi enzyme đều có tính đặc hiệu với một loại phản ứng hóa học nhất định Khi một chất có khả năng tham gia nhiều loại phản ứng, mỗi phản ứng đó cần một enzyme đặc hiệu để xúc tác Chẳng hạn, amino acid có thể thực hiện các phản ứng như khử carboxyl, khử amin bằng cách oxy hóa và vận chuyển nhóm amin, do đó, mỗi phản ứng này sẽ cần một enzyme tương ứng, bao gồm decarboxylase, aminoacid oxydase và aminotransferase.
Enzyme khác biệt rõ rệt so với các chất xúc tác hóa học khác nhờ vào tính đặc hiệu cơ chất và hiệu quả xúc tác cao Phần lớn enzyme chỉ tương tác với một số ít cơ chất tự nhiên, biến đổi chúng thành sản phẩm đơn giản với hiệu suất rất cao Cấu trúc độc đáo của trung tâm hoạt động của enzyme quyết định tính đặc hiệu này, cho phép chúng kết hợp một cách thuận lợi với các cơ chất đặc hiệu và loại trừ khả năng liên kết với các chất không phải cơ chất Mức độ đặc hiệu này được duy trì cùng với tốc độ phản ứng nhanh gấp 10^6 đến 10^12 lần so với các phản ứng tự phát không có xúc tác.
Mỗi enzyme chỉ xúc tác cho sự chuyển hóa một hoặc một số chất nhất định, và mức độ đặc hiệu cơ chất của các enzyme cũng khác nhau Các enzyme thường được phân loại theo các mức độ đặc hiệu khác nhau, phản ánh khả năng tác động của chúng đối với các chất khác nhau.
Một số enzyme hầu như chỉ xúc tác cho phản ứng chuyển hóa một cơ chất xác định và chỉ xúc tác cho phản ứng ấy mà thôi
Urease, arginase và glucose oxidase là những enzyme có cơ chất đặc hiệu như ure, arginine và β-D-glucose Tuy nhiên, chúng cũng có khả năng phân giải một số chất khác với tốc độ thấp hơn nhiều Ví dụ, urease có thể phân giải hydroxyure nhưng chậm hơn 120 lần so với ure Ngoài ra, glucose oxidase, có mặt trong các loại nấm mốc, có khả năng oxy hóa β-D-glucose thành gluconic acid.
Enzyme này có khả năng phân giải 10 cơ chất song với khả năng nhỏ hơn nhiều
Ví dụ: nếu coi tốc độ oxy hóa tương đối acid β-D-glucose là 100% thì α.D.glu- cose chỉ bằng 0,64 % (ngoài ra maltose 0,19%, D.galactose 0,14%)
Trong trường hợp đặc hiệu tuyệt đối, cấu trúc trung tâm hoạt động của enzyme tương ứng có sự liên kết chặt chẽ với cấu trúc của cơ chất Điều này có nghĩa là chỉ cần một sự khác biệt nhỏ trong cấu trúc của cơ chất cũng đủ để enzyme không thể thực hiện chức năng xúc tác.
Những enzyme có tính đặc hiệu tuyệt đối thường được dùng để định lượng chính xác cơ chất của nó
3.2.2.2 Đặc hiệu nhóm tuyệt đối
Các enzyme chỉ tác động lên các chất có cấu trúc phân tử tương đồng, với kiểu liên kết nhất định và yêu cầu cụ thể về nhóm nguyên tử ở vị trí liên kết Chẳng hạn, maltase, thuộc nhóm α-α-glucosidase, chỉ xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết glucoside được hình thành từ nhóm OH của α- glucose với nhóm OH của một monosaccharide khác.
3.2.2.3 Đặc hiệu nhóm tương đối
Mức độ đặc hiệu của các enzyme trong nhóm này thấp hơn so với nhóm trước Các enzyme này có khả năng tác động lên một loại liên kết hóa học nhất định trong phân tử cơ chất mà không phụ thuộc vào cấu trúc của các thành phần tham gia liên kết Chẳng hạn, lipase có khả năng thủy phân tất cả các liên kết este, trong khi aminopeptidase có thể xúc tác quá trình thủy phân nhiều peptid khác nhau.
3.2.2.4 Đặc hiệu quang học (đặc hiệu lập thể)
Hầu hết các enzyme đều có tính đặc hiệu không gian cao, tức là chúng chỉ tác động lên một dạng đồng phân không gian cụ thể của cơ chất.
Enzyme chỉ tác dụng với một trong hai dạng đồng phân quang học của các chất
Phản ứng khử nước của axit malic để tạo thành axit fumaric dưới tác dụng của fumarathydratase chỉ diễn ra với L-malate, trong khi D-malate không tham gia vào phản ứng này.
Enzyme có tính đặc hiệu đối với các đồng phân hình học, như enzyme fumarathydratase chỉ tác dụng với dạng trans của fumaric acid, không tác dụng với dạng cis, để tạo ra L-malate.
Trong tự nhiên cũng có các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa tương hổ giữa các cặp đồng phân không gian tương ứng
Các enzyme như lactatracemase, aldo-1-epimerase và maleinat cis-trans isomerase của vi khuẩn đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa các hợp chất hữu cơ Lactatracemase xúc tác cho phản ứng chuyển hóa giữa D và L-lactic acid, trong khi aldo-1-epimerase chuyển đổi α-D-glucose thành β-D-glucose Maleinat cis-trans isomerase giúp đồng phân hóa giữa maleic acid (dạng cis) và fumaric acid (dạng trans) Những enzyme này rất cần thiết trong sản xuất các chất dinh dưỡng qua phương pháp hóa học, vì chúng có khả năng chuyển đổi các chất từ dạng không thể sử dụng thành dạng có thể hấp thụ.
Enzyme còn có khả năng phân biệt được 2 gốc đối xứng trong phân tử giống nhau hoàn toàn về mặt hóa học
Ví dụ, hai nhóm - CH2OH trong phân tử glycerin, glycerophosphatkinase xúc tác cho phản ứng chuyển vị gốc phosphate từ ATP đến C3 của glycerin (chứ không phải C1).
HOẠT TÍNH XÚC TÁC CỦA ENZYME
Những tính chất đặc trưng của xúc tác sinh học
3.1.1 E thể hiện tính đặc hiệu cao đối với cơ chất của chúng
Một số E chỉ xúc tác một phản ứng chuyển hóa một cơ chất
Ví dụ: fumarase chỉ xúc tác phản ứng chuyển hóa giữa fumarate và malate
Cả maleat – đồng phân dạng cis của fumarat và D-malat đều không thể là cơ chất của fumarase
Các E khác có tính đặc hiệu rộng hơn Ví dụ một số E thủy phân protein cũng có thể thủy phân cả các liên kết ester và tyoester
3.1.2 Xúc tác E dẫn đến sự hình thành một phức hệ trung gian giữa E và cơ chất
Sự hình thành các phức hệ E – cơ chất trung gian trong các phản ứng enzym đã được phát hiện thông qua nhiều phương pháp khác nhau Các biện pháp này bao gồm phân tích động học, sử dụng thuốc thử đặc hiệu cho gốc R để tạo ra biến đổi hóa học, và ức chế enzym bằng các hợp chất tương tác với trung tâm hoạt động Ngoài ra, việc phát hiện quang phổ hấp thụ đặc hiệu khi enzym tác dụng với cơ chất và sử dụng tia X để xác định cấu trúc tinh thể cũng góp phần quan trọng trong nghiên cứu này.
E kết hợp với các hợp chất tương tự về mặt cấu trúc với cơ chất, …
3.1.3 Trung tâm của E tương tác đặc hiệu với cơ chất được gọi là trung tâm hoạt động
Hình dạng của một số enzyme (E) cho phép các nhóm R trong chuỗi polypeptide được sắp xếp gần nhau, tạo ra các trung tâm hoạt động đặc hiệu Cấu trúc không gian tại trung tâm hoạt động không chỉ xác định hợp chất nào có thể tương tác mà còn quy định các biến cố tiếp theo để chuyển đổi cơ chất thành sản phẩm Sự kết hợp giữa cơ chất và trung tâm hoạt động diễn ra thông qua các liên kết không đồng hóa trị đặc hiệu, và trong một số trường hợp, cả liên kết đồng hóa trị Khi cơ chất gắn kết tại trung tâm, nó được đưa gần với các nhóm R đặc hiệu của enzyme, dẫn đến sự mất ổn định của một số liên kết trong cơ chất, từ đó làm tăng tính hoạt động hóa học của nó.
3.1.4 E làm giảm năng lượng hoạt hóa cần thiết cho một phản ứng
E cũng như mọi chất xúc tác, làm tăng tốc độ của các phản ứng hóa học bằng cách làm giảm năng lượng hoạt hóa của phản ứng đặc hiệu
3.1.5 Một số E tham gia điều hòa tốc độ phản ứng Đa số cơ thẻ không thay đổi tốc độ của các phản ứng trao đổi chất khi nhiệt độ biến đối VÌ vậy các phản ứng xúc tác cần làm cho quá trình xảy ra đủ nhanh ở nhiệt độ cơ thể Hơn nữa, nếu các phản ứng sinh học xảy ra không có xúc tác thì không thể kiểm tra được tốc độ của chúng
Quá trình trao đổi chất được điều hòa bởi nhiều cơ chế khác nhau, trong đó có sự tác động của các chất hiệu ứng Những chất này có khả năng làm tăng hoặc giảm tốc độ phản ứng enzym (E) bằng cách tác động trực tiếp lên cấu trúc của E, từ đó ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng mà không thay đổi bản chất của E Sự điều hòa này là một phần quan trọng trong việc kiểm soát hoạt động enzym và duy trì sự cân bằng trong quá trình trao đổi chất.
Cơ chế của phản ứng có xúc tác nói chung
Cơ chế xúc tác của enzym khác nhau nhưng đều tuân theo nguyên tắc chung của chất xúc tác hóa học: giảm các hàng rào năng lượng cản trở phản ứng giữa các chất tham gia và sản phẩm Việc giảm năng lượng hoạt hóa (Ea) giúp tăng số lượng phân tử chất tham gia phản ứng vượt qua hàng rào năng lượng, từ đó tạo thành sản phẩm phản ứng.
Vận tốc phản ứng hóa học phụ thuộc vào năng lượng hoạt hóa, tức là mức năng lượng cần thiết để phá vỡ các liên kết cũ và hình thành liên kết mới Khi năng lượng hoạt hóa cao, vận tốc phản ứng sẽ chậm hơn, và ngược lại Các chất xúc tác giúp tăng tốc độ phản ứng bằng cách giảm năng lượng hoạt hóa cần thiết.
Bột platin là một chất xúc tác hóa học phổ biến, giúp tăng tốc độ phản ứng bằng cách chuyển đổi các chất tham gia trên bề mặt của nó sang trạng thái có khả năng phản ứng cao hơn Nhờ đó, năng lượng hoạt hóa giảm, dẫn đến tốc độ phản ứng nhanh hơn.
Chất xúc tác trong các phản ứng hóa học giúp giảm năng lượng hoạt hóa, cho phép phản ứng diễn ra dễ dàng hơn Nó chỉ tham gia vào các bước trung gian mà không biến đổi thành sản phẩm cuối cùng Sau khi phản ứng hoàn tất, chất xúc tác trở về trạng thái ban đầu, sẵn sàng để tiếp tục tham gia vào các phản ứng khác.
Cơ chế của xúc tác enzyme
Hầu hết các biến đổi hóa sinh trong tế bào và cơ thể sống đều diễn ra nhờ sự xúc tác của enzyme trong điều kiện pH trung tính, nhiệt độ và áp suất bình thường, trong khi nhiều chất xúc tác hóa học khác chỉ hoạt động hiệu quả ở nhiệt độ và áp suất cao.
Enzyme có khả năng đặc biệt nhờ tạo ra môi trường tối ưu cho phản ứng, với trung tâm hoạt động liên kết chặt chẽ với cơ chất, giúp tối ưu hóa mật năng lượng cần thiết cho quá trình này.
Trong phản ứng có sự xúc tác của enzyme, cơ chất được kích hoạt thông qua việc hình thành phức hợp trung gian enzyme - cơ chất Khi cơ chất kết hợp với enzyme, sự cực hóa, chuyển dịch electron và biến dạng các liên kết tham gia vào phản ứng làm thay đổi động năng và thế năng, từ đó làm cho phân tử cơ chất trở nên hoạt động hơn và dễ dàng tham gia vào phản ứng.
Năng lượng hoạt hóa khi có sự tham gia của enzyme xúc tác không chỉ thấp hơn nhiều so với khi không có xúc tác, mà còn thấp hơn cả so với việc sử dụng các chất xúc tác thông thường.
Trong phản ứng phân hủy H2O2 thành H2O và O2, năng lượng hoạt hóa là 18 Kcal/mol nếu không có chất xúc tác, trong khi với platin, năng lượng này giảm xuống còn 11,7 Kcal/mol Đặc biệt, khi có enzyme catalase, năng lượng hoạt hóa chỉ còn 5,5 Kcal/mol Nhiều nghiên cứu thực nghiệm đã chỉ ra rằng quá trình hình thành phức hợp enzyme - cơ chất và sự chuyển đổi của phức hợp này thành sản phẩm, giải phóng enzyme tự do, thường trải qua ba giai đoạn rõ ràng.
Trong đó E là enzyme, S là cơ chất (Substrate), ES là phức hợp enzyme - cơ chất, P là sản phẩm (Product)
Trong giai đoạn đầu tiên, enzyme kết hợp với cơ chất thông qua các liên kết yếu, hình thành phức hợp enzyme - cơ chất (ES) không bền Phản ứng này diễn ra nhanh chóng và yêu cầu mức năng lượng hoạt hóa thấp.
- Giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng
- Giai đoạn thứ ba: tạo thành sản phẩm, còn enzyme được giải phóng ra dưới dạng tự do
Các loại liên kết chính giữa enzyme (E) và cơ chất (S) trong phức hợp ES bao gồm tương tác tĩnh điện, liên kết hydrogen và tương tác Van der Waals, mỗi loại liên kết yêu cầu các điều kiện khác nhau và bị ảnh hưởng bởi sự hiện diện của nước Nghiên cứu bằng phương pháp tia X và hóa học đã làm sáng tỏ cách thức gắn kết cơ chất cũng như cơ chế hoạt động của nhiều enzyme, chẳng hạn như lysozyme, chymotrypsin và carboxypeptidase A Bài viết này sẽ đi sâu vào cơ chế phản ứng của carboxypeptidase A.
Carboxypeptidase A (EC 3.4.17.1) là một loại enzyme thuộc nhóm peptidhydrolase, có khả năng xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptid, đặc biệt hiệu quả khi amino acid ở đầu C là amino acid thơm Ngoài ra, enzyme này còn có khả năng thủy phân liên kết este.
Carboxypeptidase A có khối lượng phân tử 34,3 KDa chứa 1 mol Zn/1 mol E
Kẽm (Zn) đóng vai trò quan trọng trong hoạt động xúc tác của enzyme Việc thay thế Zn bằng các kim loại hóa trị hai khác có thể làm thay đổi cả hoạt độ và tính đặc hiệu của enzyme Trong cấu trúc của enzyme, Zn nằm gần bề mặt phân tử và tương tác với gốc histidine (His) tại vị trí 69.
Các gốc amino acid có vai trò xúc tác trong trung tâm hoạt động của enzyme là: Arg - 145, Tyr - 248 và Glu - 270
Cơ chế phản ứng xúc tác của Carboxypeptidase A đã được xác định thông qua nghiên cứu phản ứng với dipeptid glycyltyrosine Quá trình phân giải liên kết peptid có thể chia thành nhiều bước khác nhau.
Khi enzyme tiếp xúc với cơ chất, các nhóm trong trung tâm hoạt động của enzyme sẽ thay đổi vị trí trong không gian Cụ thể, nhóm guanidin của Arg - 145 và nhóm carboxyl của Glu - 270 dịch chuyển 2Å, trong khi nhóm hydroxyl của Tyr cũng có sự thay đổi vị trí.
- 248 dịch chuyển 12Å từ chỗ gần trên bề mặt phân tử chuyền vào trong đến vùng gần với liên kết peptid của cơ chất
Tương tác giữa các nhóm chức của trung tâm hoạt động với glycyltyrosine như sau:
Hình 3.1: Sơ đồ biểu diễn tương tác giữa glycyltyrosine với các nhóm chức năng trong trung tâm hoạt động của carboxypeptidase A
- Nhóm carboxyl tự do của cơ chất kết hợp với nhóm tích điện dương của Arg
- 145 của enzyme qua liên kết ion
- Nhóm NH trong liên kết peptide của cơ chất tạo thành liên kết hydrogen với nhóm - OH của Tyr - 248
- Oxy trong nhóm - CO - của liên kết peptide tương tác với Zn, còn carbon trong nhóm - CO - này tương tác với nhóm carboxyl của Glu - 270 qua phân tử nước
Cắt đứt liên kết giữa nguyên tử Zn và CO làm tăng tính ái điện tử của nguyên tử carbon, từ đó tăng cường tương tác của carbon với nước hoặc với nhóm ái nhân của phân tử protein enzyme.
Gốc Glu tại vị trí 270 hoạt hóa phân tử nước, với nhóm -OH tấn công trực tiếp vào nguyên tử cacbon của liên kết peptide -CO, dẫn đến việc kéo căng và đứt gãy liên kết peptide Đồng thời, gốc Tyr tại vị trí 248 nhường hydrogen cho nhóm NH trong liên kết peptide của cơ chất, giải phóng sản phẩm đầu tiên là tyrosine và acyl-enzyme.
Hình 3.2: Cơ chế phản ứng xúc tác của carboxypeptidase A
Sau khi liên kết peptide bị cắt đứt, trạng thái ion hóa của các nhóm acid và base thay đổi theo pH môi trường Cụ thể, Tyr - 248 kết hợp với proton và trở về trạng thái ban đầu.
KĨ THUẬT PROTEIN
Tìm hiểu về kĩ thuật protein
Kỹ thuật protein là sự kết hợp giữa tinh thể học protein, hóa học protein và thiết kế máy tính hỗ trợ, nhằm phát triển các kỹ thuật di truyền Nó dựa trên kiến thức đa ngành về gen nhân tạo, phục vụ cho việc chuyển đổi, sửa đổi và ghép nối protein, đáp ứng nhu cầu nhân lực trong công nghệ protein mới.
Kỹ thuật protein, hay còn gọi là kỹ nghệ protein, là phương pháp thay đổi cấu trúc phân tử của protein tự nhiên, đặc biệt là enzyme, nhằm cải thiện các đặc tính phù hợp với nhiều lĩnh vực ứng dụng khác nhau Kỹ thuật này liên quan đến việc sửa đổi trình tự nucleotide của gen mã hóa, cho phép thay đổi các axit amin trong protein Điều này dẫn đến việc sử dụng đoạn DNA tổng hợp làm khuôn để sản xuất các phân tử protein tái tổ hợp mới thông qua các tế bào chủ hoặc hệ thống sinh học khác, với đầy đủ yếu tố cần thiết cho quá trình phiên mã và dịch mã Quá trình sinh tổng hợp thường bao gồm nhân bản DNA, trong đó gen mã hóa cho protein được chèn vào plasmid nhân dòng hoặc plasmid biểu hiện, tạo thành một quy trình phức tạp với các bước cơ bản.
1 Cắt/mở plasmid và "dán" gen, tạo plasmid tái tổ hợp Quá trình này phụ thuộc vào các enzyme hạn chế (cắt và nối DNA ở những vị trí xác định)
2 Chuyển (biến nạp) plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn Sử dụng lựa chọn kháng sinh để xác định vi khuẩn có chứa plasmid tái tổ hợp
3 Nhân nuôi các loại vi khuẩn mang plasmid và sử dụng chúng như là
Các nhà máy chuyên sản xuất protein và enzyme thu hoạch từ nuôi cấy vi khuẩn, tiến hành làm sạch và ứng dụng chúng cho nhiều mục đích khác nhau.
Kỹ nghệ protein được sử dụng rộng rãi để tổng hợp enzyme thiết kế, phục vụ cho nhiều lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học Các phương pháp liên quan đến kỹ nghệ protein đã được công bố theo trình tự thời gian, bao gồm thiết kế hợp lý, đột biến điểm định hướng, phương pháp tiến hóa, đột biến ngẫu nhiên, DNA shuffling, động học phân tử, mô hình tương tự, peptidomimetics, công nghệ phage display, hệ sinh tổng hợp không tế bào, kỹ nghệ enzyme de novo, và mRNA display.
Các protein và enzym mới có thể được tổng hợp bằng phương pháp hóa học, trong đó chuỗi polypeptit được lắp ráp từ các axit amin khác nhau dưới sự kiểm soát của hóa chất Phản ứng này bắt đầu với một chất hỗ trợ vững chắc, và các hóa chất chọn lọc quyết định axit amin nào sẽ được liên kết Các hóa chất có thể được bổ sung hoặc thay đổi trong suốt quá trình Sau khi tổng hợp, polypeptide được phân tách và tinh chế Do chức năng của protein và enzym phụ thuộc vào cấu trúc không gian của phân tử, quá trình thiết kế thường sử dụng mô phỏng máy tính với công cụ tin sinh chuyên biệt Hiện nay, cả cấu trúc và chức năng của protein hay enzym tổng hợp đều có thể được thiết kế qua công cụ tin sinh hoặc sản xuất qua quá trình phát triển định hướng ở quy mô phòng thí nghiệm và công nghiệp.
Kỹ thuật protein là một công nghệ tiên tiến kết hợp DNA tái tổ hợp, hóa sinh, sinh học phân tử và di truyền học để nghiên cứu và phát triển protein Nó tập trung vào hai khía cạnh chính: tổng hợp chuỗi amino acid và xác định cấu trúc không gian của protein Bằng cách phân tích thành phần hóa học, cấu trúc không gian và chức năng sinh học, kỹ thuật này cho phép dự đoán cấu trúc protein từ chuỗi axit amin và thiết kế các protein mới với chức năng sinh học đặc biệt Đây là những mục tiêu cơ bản của kỹ thuật protein, mở ra nhiều hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực sinh học.
Kỹ thuật protein là công cụ quan trọng giúp tăng cường hoạt tính enzyme, tính chọn lọc cơ chất và sự bền nhiệt, góp phần cách mạng hóa sự phát triển enzyme công nghiệp Kỹ thuật này bao gồm việc thiết kế và xây dựng protein với các chức năng mong muốn thông qua hai phương pháp chính: tiến hóa có định hướng và thiết kế duy lý Sản phẩm protein từ kỹ thuật này có thể được cải biến bằng cách thay đổi một hoặc nhiều amino axit, cũng như điều chỉnh cấu trúc cuộn gập của chuỗi amino axit, nhằm tạo ra các enzyme bền vững và có lợi.
Có nhiều công cụ được sử dụng trong cải biến enzyme tùy thuộc vào mục tiêu cụ thể (bảng 1).
Bảng 4.1 Các công cụ sử dụng trong kỹ thuật protein
Cấu trúc protein Kết tinh, tinh thể học tia X, cộng hưởng từ hạt nhân
Mô hình hóa và mô phỏng Mô phỏng tính toán
Gen Plasmids, các hệ thống biểu hiện, các đột biến hướng đích, PCR DNA shuffling, đột biến ngẫu nhiên
Kỹ thuật protein đã trở thành phương pháp phổ biến nhằm cải thiện hoạt động và tính ổn định của enzym, đồng thời mở rộng khả năng sản xuất các sản phẩm tự nhiên Bài đánh giá này tóm tắt những tiến bộ gần đây và các chiến lược điển hình trong lĩnh vực kỹ thuật protein, nhấn mạnh vai trò quan trọng của nó trong việc nâng cao và đa dạng hóa quá trình sinh tổng hợp sản phẩm tự nhiên Ngoài ra, triển vọng tương lai và các hướng nghiên cứu cũng được đề cập.
Kỹ thuật protein hiện nay không có một định nghĩa thống nhất, mà thường liên quan đến việc thay đổi công nghệ gen tái tổ hợp để thiết kế và tổng hợp các protein có chức năng sinh học cụ thể Sự phân loại kỹ thuật protein bao gồm thanh lọc, cấu trúc và phân tích chức năng, cũng như thiết kế và dự đoán protein thông qua các phương tiện sửa đổi hoặc tạo ra protein Thông qua các phương pháp vật lý hóa học, sinh học và công nghệ chuyển đổi, các protein tái tổ hợp hoặc thiết kế mới được tổng hợp với chức năng cụ thể Việc áp dụng kỹ thuật di truyền cho phép giới thiệu đột biến vào chuỗi axit amin, từ đó thay đổi cấu trúc không gian của protein mục tiêu nhằm cải thiện chức năng của nó Các phương pháp truyền thống thường sử dụng đột biến ngẫu nhiên để biến đổi protein-enzym, nhưng với sự phát triển nhanh chóng của công nghệ máy tính và tin sinh học, mô phỏng máy tính ngày càng được áp dụng, mang lại thiết kế hợp lý và cải tiến cho kỹ thuật protein.
Một trong những thách thức lớn trong quá trình tổng hợp sản phẩm tự nhiên là sự hạn chế trong hoạt động của enzym Việc tích hợp nhiều loại enzym vào khung vi sinh có thể làm giảm hiệu quả xúc tác hoặc thậm chí gây mất chức năng Do đó, mục tiêu chính trong nghiên cứu là tăng cường hoạt động của enzym nhằm đẩy nhanh quá trình sản xuất Một chiến lược phổ biến trong kỹ thuật protein là cải thiện khả năng xúc tác của enzym đối với các chất nền cụ thể thông qua phương pháp gây đột biến ngẫu nhiên.
Một tyrosine hydroxylase có hoạt tính trên nấm men đã được xác định và cải thiện hoạt tính xúc tác của nó lên 4,3 lần thông qua việc gây đột biến ngẫu nhiên bằng PCR dễ bị lỗi.
Sự đồng biểu hiện sâu hơn của decarboxylase L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) và tyrosine hydroxylase được thiết kế đã cho phép chứng minh sản xuất de novo dopamine ở nấm men.
Hoạt tính xúc tác của isopentenyl diphosphat isomerase (IDI) từ nấm men Saccharomyces cerevisiae đã được cải thiện 2,53 lần nhờ vào phương pháp gây đột biến ngẫu nhiên dựa trên PCR Sự gia tăng hoạt tính của IDI đã dẫn đến hiệu suất lycopene đạt 1,24 g/L, tăng gấp 2,1 lần so với chủng hoang dã.
Các phương pháp và kỹ thuật
4.2.1 Kĩ thuật DNA tái tổ hợp
DNA là chữ viết tắt của axit 2’-deoxyribonucleic, được nhà sinh học người
Vào năm 1869, Thụy Điển Miescher phát hiện ra một chất trong nhân tế bào bạch cầu và đặt tên là nuclein, có nghĩa là hạch nhân Sau đó, ông nhận ra bản chất axit của nó và gọi là axit nucleic Sau hơn 80 năm tranh cãi giữa các nhà khoa học, đến năm 1952, DNA mới được công nhận là vật chất di truyền.
DNA cấu thành từ ba thành phần chính: các bazơ nitơ purine và pyrimidine (A, T, C, G), đường pentose (đường 5 carbon) và axit phosphoric (H3PO4) Tỷ lệ của ba thành phần này là 1:1:1, và chúng liên kết với nhau để tạo thành một nucleotide.
Hình 4.1: Cấu tạo một nucleotide b/DNA tái tổ hợp:
Cấu trúc đặc biệt của phân tử DNA và sự bắt cặp nghiêm ngặt của các bazơ nitơ đã dẫn đến ý tưởng tạo ra những đuôi ở một trong hai sợi DNA khác nhau, cho phép chúng nối lại với nhau nhờ vào sự bắt cặp bổ sung Quá trình này được gọi là DNA tái tổ hợp, hay DNA lai, được thực hiện trong ống nghiệm (in vitro) bằng cách kết hợp hai DNA thuộc hai loài khác nhau.
Hai vector như plasmid và phage λ có thể được sử dụng để cài mảnh DNA lạ, tạo ra DNA tái tổ hợp Những đoạn DNA lạ này, được gọi là DNA ngoại lai, bao gồm các gen mà các nhà nghiên cứu quan tâm và được ghép vào DNA của plasmid hoặc DNA của virus.
Hình 4.2: Mô hình biểu diễn sự tạo ra DNA tái tổ hợp
4.2.1.2 Mục đích tạo DNA tái tổ hợp
DNA tái tổ hợp được chế tác nhằm thực hiện quá trình tách dòng, cho phép tách lập và thu nhận nhiều bản sao đồng nhất của một gen hoặc đoạn DNA Quá trình tách dòng có thể diễn ra mà không cần biểu hiện protein Ứng dụng của DNA tái tổ hợp bao gồm việc thiết lập ngân hàng bộ gen, cDNA, cũng như tổng hợp protein, enzyme và hormone.
4.2.1.3 những yêu cầu của DNA tái tổ hợp
- DNA tái tổ hợp phải đạt được những yêu cầu cần thiết của một vector chuyển gen
- DNA tái tổ hợp phải có hoạt tính khi đưa vào tế bào chủ
- DNA tái tổ hợp phải có những dấu hiệu dễ phát hiện trong quần thể vi khuẩn
Và dễ quan sát sự hoạt động và biểu hiện của gen tái tổ hợp
4.2.1.4 các công đoạn chính tạo DNA tái tổ hợp a/ chọn nguyên liệu
DNA plasmid và DNA phage thường được chọn làm vector để vận chuyển gen, chủ yếu được thu nhận từ tế bào vi sinh vật Các loại DNA này được tách và làm sạch thông qua phương pháp chiết tách DNA plasmid và DNA virus.
DNA chứa gen cần nghiên cứu được thu nhận từ tế bào sinh vật thông qua quy trình chiết tách, làm sạch và kiểm tra Bên cạnh đó, DNA tổng hợp cũng được sản xuất bằng phương pháp hóa học hoặc từ mRNA nhờ enzyme sao chép ngược, sử dụng cơ chế nuclease S1 hoặc kỹ thuật Gubler-Hoffman.
Các enzyme như enzyme restriction và enzyme ligase đóng vai trò quan trọng trong việc cắt và nối các đoạn DNA Sự hợp tác của các enzyme khác như kinase và alkaline phosphatase cũng góp phần vào quá trình này Đặc biệt, công đoạn cắt DNA diễn ra với sự tham gia của enzyme restriction kiểu II.
Enzyme cắt hạn chế kiểu II (RE) là những enzyme có khả năng cắt DNA tại các vị trí xác định, đóng vai trò quan trọng trong công nghệ DNA tái tổ hợp Chúng chỉ có một kiểu hoạt tính cắt và không cần năng lượng ATP, chỉ yêu cầu ion Mg²⁺ để hoạt động Mỗi enzyme cắt DNA tại những vị trí đã được xác định trước, ngay bên trong hoặc cạnh trình tự nhận biết, mang lại sự chính xác và hiệu quả trong các ứng dụng sinh học phân tử.
Các enzyme giới hạn cắt DNA thành hai mảnh với đầu bằng hoặc đầu dính, tùy thuộc vào nhiều yếu tố như hàm lượng enzyme, nhiệt độ, ion kim loại, môi trường đệm, pH và độ tinh khiết của DNA Sau đó, quá trình nối được thực hiện với sự tham gia của enzyme DNA ligase.
Bước tiếp theo trong kỹ thuật di truyền là kết nối các đoạn DNA vào vector chuyển gen để tạo ra plasmid mang DNA lạ, quá trình này được thực hiện nhờ enzyme DNA ligase Enzyme này xúc tác phản ứng nối hai mảnh DNA bằng cách tạo cầu nối phosphodiester giữa đầu 5’(P) và đầu 3’(OH) của các nucleotide liền kề Trong sinh học phân tử, DNA ligase được coi là một chất keo phân tử, giúp liên kết các mẫu DNA với nhau.
Nối đầu bằng là quá trình xảy ra khi hai đoạn DNA đầu bằng đứng cạnh nhau, trong đó enzyme ligase giúp hình thành liên kết phosphodiester giữa đầu 5’ (P) và đầu 3’ (OH), nối hai nucleotide lại với nhau Tuy nhiên, khả năng nối hai đoạn DNA đầu bằng rất thấp, vì vậy để tăng hiệu suất phản ứng, cần phải tăng nồng độ của các đoạn DNA.
Nối đầu lệch xảy ra khi hai mảnh DNA với các bazơ bổ sung tiến lại gần nhau, tạo liên kết hydro giữa các bazơ nitơ Sau đó, enzyme DNA ligase xúc tác hình thành liên kết este giữa OH(3’) và P(5’) của hai nucleotide, hoàn thành quá trình nối lại.
Hình 4.3: DNA và các phản ứng nối
4.2.1.5 Các phương pháp tạo DNA tái tổ hợp a/ Phương pháp đơn giản dùng đầu lệch
Chọn và xử lý DNA plasmid là quy trình quan trọng trong nghiên cứu sinh học phân tử Plasmid được tách ra từ tế bào E Coli hoặc tế bào nấm men thông qua phương pháp chiết tách DNA plasmid Sau khi tách, enzyme RE II, chẳng hạn như EcoRI, được sử dụng để cắt plasmid, tạo ra một plasmid hở với hai đầu lệch nhau.
Trong quá trình nghiên cứu, DNA đoạn cài được thu nhận, lựa chọn và tinh chế theo mục đích cụ thể Để tạo ra các vết cắt giống nhau, DNA được cắt bằng enzyme RE loại II, cùng loại với enzyme cắt plasmid (EcoRI).
